Synergiczne działanie CFX i RSL3 w terapii przeciwnowotworowej

Czy synergiczne działanie CFX i RSL3 otwiera nowe perspektywy terapeutyczne?

Nowy mechanizm zwiększania wrażliwości komórek nowotworowych na ferroptozę poprzez synergistyczne działanie ciprofloksacyny i RSL3 może otworzyć drzwi do innowacyjnych terapii przeciwnowotworowych. Badacze zidentyfikowali nieoczekiwaną rolę powszechnie stosowanego antybiotyku w potencjalizacji śmierci komórek nowotworowych, co może mieć znaczące implikacje kliniczne.

Ferroptoza, rodzaj regulowanej śmierci komórkowej charakteryzujący się zależnym od żelaza uszkodzeniem oksydacyjnym i peroksydacją lipidów błonowych, zyskuje coraz większe zainteresowanie jako potencjalny cel terapeutyczny w leczeniu nowotworów. Dotychczasowe badania wskazują, że indukcja ferroptozy może zwiększać skuteczność chemioterapii, radioterapii i immunoterapii. Jednak mechanizmy molekularne i modulacja ferroptozy są wysoce zależne od kontekstu, różniąc się w zależności od typu komórek i charakteru bodźców zewnętrznych.

Czy ciprofloksacyna wzmacnia efekt ferroptozy indukowany przez RSL3?

W najnowszym badaniu naukowcy przeprowadzili screening 50 antybiotyków stosowanych klinicznie pod kątem ich synergistycznych interakcji z RSL3 – inhibitorem GPX4 indukującym ferroptozę. Wśród badanych antybiotyków, ciprofloksacyna (CFX) – antybiotyk z grupy fluorochinolonów – wykazała najsilniejszy efekt synergistyczny z RSL3 w komórkach raka trzustki (PANC1).

“Nasze badania ujawniły, że ciprofloksacyna w subtoksycznych stężeniach istotnie uwrażliwia komórki nowotworowe na ferroptozę indukowaną przez RSL3, co otwiera nowe możliwości terapeutyczne” – piszą autorzy badania.

Co ciekawe, wcześniejsze badania wykazały, że CFX może hamować ferroptozę indukowaną przez erastin poprzez stabilizację białka GPX4. Jednak w przypadku RSL3, który bezpośrednio hamuje aktywność GPX4, CFX paradoksalnie nasila śmierć komórek. Ta dwukierunkowa rola CFX wzbudziła zainteresowanie badaczy, którzy postanowili zgłębić mechanizmy molekularne leżące u podstaw tego zjawiska.

Badania przeprowadzone na różnych liniach komórek nowotworowych, w tym PANC1, SW1990 (linia komórkowa raka trzustki), HeLa (linia komórkowa raka szyjki macicy) i OVCAR-3 (linia komórkowa raka jajnika), potwierdziły synergistyczny efekt CFX z RSL3. Kombinacja tych dwóch związków znacząco hamowała proliferację komórek nowotworowych i indukowała śmierć komórkową poprzez ferroptozę, co potwierdzono za pomocą liproksstatyny-1 (Lip-1), specyficznego inhibitora ferroptozy, który łagodził efekty kombinacji CFX-RSL3.

Jakie mechanizmy molekularne odpowiadają za selektywność działania CFX?

Aby zrozumieć mechanizm działania CFX w kontekście ferroptozy indukowanej przez RSL3, badacze przeanalizowali kluczowe szlaki sygnałowe związane z tym procesem. Odkryli, że kombinacja CFX-RSL3 znacząco zwiększała poziomy reaktywnych form tlenu (ROS) w lipidach oraz produkcję aldehydu malonowego (MDA), kluczowych wskaźników peroksydacji lipidów. Co istotne, kombinacja CFX-RSL3 nie wpływała znacząco na poziom wewnątrzkomórkowego Fe²⁺ ani glutationu (GSH), co sugeruje, że efekt synergistyczny CFX na ferroptozę indukowaną przez RSL3 może działać poprzez alternatywne ścieżki.

Badacze sprawdzili również specyficzność działania CFX na śmierć komórkową indukowaną przez RSL3, oceniając jego wpływ na śmierć komórkową indukowaną przez inne mechanizmy, w tym nekroptozę (wywoływaną przez TNF-α, SM-164 i Z-VAD-FMK [TSZ]) oraz apoptozę (wywoływaną przez staurosporynę [STS]). CFX wykazał znikomy wpływ na skuteczność tych induktorów śmierci komórkowej, co wskazuje, że jego zdolność do potencjalizacji przeciwnowotworowego działania RSL3 jest selektywna dla ferroptozy.

Czy interakcje TOP2B, STING1 i CAV2 napędzają proces ferroptozy?

Dalsze badania ujawniły, że CFX wpływa na wrażliwość komórek nowotworowych na RSL3 poprzez szlak topoisomerazy 2β-STING1. Topoisomeraza 2β (TOP2B) jest selektywnie obniżana w komórkach nowotworowych poddanych działaniu kombinacji CFX-RSL3, a hamowanie TOP2B zwiększa inhibicję żywotności komórek indukowaną przez tę kombinację.

TOP2B jest zlokalizowana zarówno w jądrze, jak i mitochondriach, gdzie odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy DNA jądrowego i mitochondrialnego (mtDNA). Badacze wykazali, że kombinacja CFX-RSL3 prowadzi do obniżenia poziomu TOP2B w mitochondriach bez znaczącego wpływu na TOP2B w jądrze. Co więcej, ekspozycja na CFX-RSL3 przez 24 godziny podwyższała poziom cytoplazmatycznego mtDNA w komórkach nowotworowych.

Uwolnienie mtDNA do cytoplazmy może działać jako wzorzec molekularny związany z uszkodzeniem (DAMP), uruchamiając różne szlaki sygnałowe, w tym aktywację stymulatora interferon response cGAMP interactor 1 (STING1). STING1 został wcześniej powiązany ze zwiększoną wrażliwością na ferroptozę. Badacze odkryli, że farmakologiczne i genetyczne zahamowanie STING1 znacząco zmniejszało hamowanie żywotności komórek, śmierć komórkową i produkcję reaktywnych form tlenu (ROS) indukowane przez kombinację CFX-RSL3.

Aby wyjaśnić mechanizm, poprzez który STING1 uwrażliwia komórki na ferroptozę, badacze przeprowadzili koimmunoprecypitację, a następnie spektrometrię masową w celu identyfikacji białek wiążących się ze STING1. Wśród białek oddziałujących ze STING1, kaweolina-2 (CAV2) – białko błonowe zaangażowane w endocytozę, przepływ jonów, dystrybucję cholesterolu i metabolizm lipidów – odgrywało kluczową rolę w zależnym od STING1 uwrażliwieniu na ferroptozę.

Western blot i analizy IP ujawniły, że kombinacja CFX i RSL3 nie tylko zwiększała ekspresję CAV2, ale także wzmacniała jego wiązanie ze STING1. Wyciszenie lub farmakologiczne zahamowanie STING1 częściowo znosiło wzrost CAV2 indukowany przez kombinację CFX-RSL3, sugerując, że interakcja między STING1 i CAV2 odgrywa kluczową rolę w stabilizacji poziomów białka.

Dalsze analizy na poziomie transkryptu wykazały, że ekspresja mRNA CAV2 nie była znacząco zmieniona przez leczenie CFX-RSL3. Testy z cykloheksymidem wskazywały na wydłużony okres półtrwania CAV2 w komórkach PANC1 i HeLa po leczeniu CFX-RSL3. Badanie mechanizmów degradacji CAV2 wykazało, że MG132, inhibitor układu ubikwityna-proteasom, indukował akumulację CAV2, podczas gdy hydroksychlorochina, inhibitor autofagii, nie miała wpływu. Te wyniki sugerują, że wiązanie STING1 z CAV2 chroni CAV2 przed degradacją przez układ ubikwityna-proteasom, stabilizując w ten sposób białko.

Aby zbadać rolę CAV2 w uwrażliwianiu na ferroptozę indukowaną przez CFX-RSL3, badacze zastosowali shRNA do wyciszenia ekspresji CAV2. Wyciszenie CAV2 łagodziło hamowanie żywotności komórek, śmierć komórkową i akumulację lipidowych ROS indukowanych przez CFX-RSL3, potwierdzając rolę CAV2 jako wzmacniacza uwrażliwienia na ferroptozę. Co więcej, wyciszenie CAV2 nie wpływało na apoptozę indukowaną przez STS ani na nekroptozę indukowaną przez TSZ, co podkreśla specyficzność jego roli w ferroptozie.

Jak zaburzenia homeostazy Zn²⁺ wpływają na funkcję mitochondriów?

Aby odkryć mechanizm, poprzez który CAV2 zwiększa wrażliwość na ferroptozę, badacze zbadali jego syntezę i funkcje. CAV2 jest syntetyzowana w retikulum endoplazmatycznym, dojrzewa w aparacie Golgiego i jest następnie transportowana do błony komórkowej, gdzie uczestniczy w tworzeniu kaweoli. Kaweole to wyspecjalizowane wgłębienia błonowe zaangażowane w procesy takie jak endocytoza i kierowanie do kropli lipidowych. Mimo funkcjonalnego związku kaweoli z kroplami lipidowymi, leczenie CFX-RSL3 nie zmieniało poziomów kropli lipidowych w komórkach nowotworowych.

Badacze odkryli, że kombinacja CFX-RSL3 selektywnie podwyższała wewnątrzkomórkowe poziomy Zn²⁺, bez zmian w Ca²⁺. Ponadto, TPEN – chelator Zn²⁺ – częściowo odwracał hamowanie żywotności komórek indukowane przez CFX-RSL3 i akumulację Zn²⁺, podkreślając kluczową rolę Zn²⁺ w tym procesie.

Badacze zbadali również źródło nadmiaru Zn²⁺ podczas leczenia CFX-RSL3. Ponieważ DMEM (medium hodowlane) nie zawiera Zn²⁺, surowica jest głównym zewnątrzkomórkowym źródłem Zn²⁺. Aby to potwierdzić, komórki traktowano CFX i RSL3 w DMEM bez surowicy i oceniano żywotność komórek za pomocą testów luminescencji ATP. W nieobecności surowicy cytotoksyczność indukowana przez RSL3 była znacznie zmniejszona, a efekt uwrażliwiający CFX został zniesiony. Efekt ten został przywrócony po egzogennym dodaniu Zn²⁺, potwierdzając, że zewnątrzkomórkowy Zn²⁺ jest niezbędny do uwrażliwienia na ferroptozę indukowaną przez CFX-RSL3.

Dalsze badania wykazały, że Zn²⁺ preferencyjnie kolokalizuje z mitochondriami. Nadmiar Zn²⁺ zaburza funkcję mitochondriów, prowadząc do podwyższonych poziomów ROS. Zgodnie z tym, leczenie CFX-RSL3 powodowało fragmentację mitochondriów i redukcję potencjału błony mitochondrialnej, wskazując na dysfunkcję mitochondriów.

CFX-RSL3 zwiększał również poziomy mitochondrialnych ROS (mtROS, wykrywanych za pomocą sond MitoSOX) i całkowitych ROS (wykrywanych za pomocą 2′,7′-dichlorodihydrofluoresceiny dioctanu), mierzonych za pomocą cytometrii przepływowej. Efekty te były łagodzone przez zmiatacz mtROS Mito-TEMPO i ogólny zmiatacz ROS N-acetylocysteinę, które również odwracały hamowanie żywotności komórek indukowane przez CFX-RSL3. Chelator jonów cynku łagodził akumulację mtROS indukowaną przez CFX-RSL3, sugerując, że dysfunkcja mitochondriów i produkcja ROS związane z Zn²⁺ leżą u podstaw efektów uwrażliwiających CFX na ferroptozę indukowaną przez RSL3.

Aby zbadać mechanizm transportu Zn²⁺ do mitochondriów, badacze przeanalizowali ekspresję solute carrier family 25 member 25 (SLC25A25), białka błony mitochondrialnej zaangażowanego w transport Zn²⁺. Ani poziomy mRNA, ani poziomy białka SLC25A25 nie były znacząco zmienione po leczeniu CFX-RSL3. Jednak wyciszenie SLC25A25 zmniejszało kolokalizację Zn²⁺ z mitochondriami pomimo ciągłego wzrostu poziomów cytoplazmatycznego Zn²⁺ pod wpływem leczenia CFX-RSL3, wskazując, że SLC25A25 ułatwia przepływ Zn²⁺ do mitochondriów. Ponadto, wyciszenie SLC25A25 częściowo ratowało hamowanie żywotności komórek indukowane przez CFX-RSL3 i akumulację mtROS.

Czy nowe mechanizmy przekładają się na praktykę kliniczną?

“Nasze odkrycia wykazują, że ciprofloksacyna wzmacnia przeciwnowotorowe właściwości RSL3 poprzez promowanie ferroptozy za pośrednictwem szlaku STING1-CAV2-Zn²⁺, napędzanego przez przeciążenie wewnątrzkomórkowe Zn²⁺“ – podsumowują badacze.

Badania te mają istotne implikacje dla rozwoju nowych strategii terapeutycznych. Ferroptoza zyskuje na znaczeniu jako potencjalny cel w leczeniu nowotworów, zwłaszcza tych opornych na konwencjonalne terapie. Dysregulacja ferroptozy jest często związana z opornością na chemioterapię, przyczyniając się do niepowodzenia leczenia. Z drugiej strony, farmakologiczna lub genetyczna modulacja ferroptozy wykazała obiecujące wyniki w przezwyciężaniu oporności.

Hamowanie GPX4, kluczowego enzymu w szlaku ferroptozy, skutecznie indukuje śmierć komórek nowotworowych. Jednakże hamowanie GPX4 wiąże się z działaniami niepożądanymi, takimi jak ostre uszkodzenie nerek i immunosupresja w modelach przedklinicznych. Zastosowanie ciprofloksacyny jako adiuwantu mogłoby zwiększyć skuteczność inhibitorów GPX4 przy jednoczesnym minimalizowaniu toksyczności. Ciprofloksacyna jest dobrze znanym antybiotykiem o udokumentowanym profilu bezpieczeństwa, co ułatwia jej potencjalne zastosowanie w nowych wskazaniach.

Topoisomerazy są niezbędnymi enzymami, które rozwiązują problemy superhelikalnego skręcenia i splątania DNA podczas replikacji, transkrypcji i segregacji chromosomów. Działają poprzez indukowanie tymczasowych pęknięć w niciach DNA, a następnie ich ponowne łączenie. Ta aktywność jest krytyczna dla szybko dzielących się komórek, takich jak komórki nowotworowe. TOP2B, cel w chemioterapii nowotworów, jest głównie zlokalizowany w jądrze, gdzie jego hamowanie indukuje apoptozę. Jednak wyniki badaczy sugerują, że CFX w połączeniu z RSL3 nie prowadzi do obniżenia poziomu jądrowego TOP2B i uszkodzenia DNA jądrowego, ale raczej do zahamowania poziomu białka mitochondrialnego TOP2B, prowadząc do zaburzenia homeostazy mtDNA. To unikalne odkrycie sugeruje, że dalsza eksploracja hamowania mitochondrialnego TOP2B przez CFX mogłaby ujawnić nowe strategie terapeutyczne.

STING1, ewolucyjnie zachowane białko transbłonowe, jest zwykle aktywowane przez cytoplazmatyczne DNA (w tym mtDNA) poprzez szlak cGAS-STING1, prowadząc do produkcji interferonów typu I i cytokin prozapalnych. Poza swoją kanoniczną rolą w odporności wrodzonej, STING1 został powiązany z ferroptozą poprzez modulację autofagii i zmianę dynamiki mitochondriów. Odkrycia badaczy pokazują, że leczenie CFX-RSL3 nie indukuje fosforylacji STING1, charakterystycznej cechy jego kanonicznej aktywacji. Zamiast tego, CFX-RSL3 promuje interakcję STING1 z CAV2, prowadząc do stabilizacji ekspresji CAV2.

CAV2 jest kluczowym składnikiem kaweoli, wyspecjalizowanych struktur błonowych związanych z odpowiedzią na stres. Co ciekawe, ekspresja CAV2 nie jest podwyższona przez sam CFX lub RSL3, ale jest znacznie zwiększona przez ich kombinację, sugerując kompensacyjną odpowiedź w komórkach nowotworowych. Biorąc pod uwagę ustaloną rolę CAV2 w promowaniu proliferacji nowotworów, ukierunkowanie na ten szlak wraz z hamowaniem GPX4 może oferować możliwości terapeutyczne.

Odkrycie nowego mechanizmu zwiększania wrażliwości komórek nowotworowych na ferroptozę poprzez modulację szlaku STING1-CAV2-Zn²⁺ może również prowadzić do identyfikacji nowych celów terapeutycznych. Badacze sugerują, że ukierunkowanie na SLC25A25 – białko błony mitochondrialnej zaangażowane w transport Zn²⁺ – mogłoby uwrażliwić komórki nowotworowe na stres mitochondrialny, induktory ferroptozy i uszkodzenia oksydacyjne. Poza rolą w transporcie Zn²⁺, SLC25A25 jest krytyczny dla funkcji mitochondriów i metabolizmu komórkowego, w tym regulacji homeostazy Ca²⁺ i Mg²⁺ w mitochondriach.

Czy te obiecujące wyniki przedkliniczne przełożą się na korzyści kliniczne? Jakie wyzwania mogą pojawić się przy implementacji tej strategii terapeutycznej? Te pytania pozostają otwarte i wymagają dalszych badań, w tym badań in vivo i oceny bezpieczeństwa.

Podsumowując, badanie to ujawnia nowy mechanizm, poprzez który niskie dawki ciprofloksacyny synergistycznie działają z RSL3 w indukcji ferroptozy. Ta synergia obejmuje hamowanie mitochondrialnego TOP2B, stres mtDNA, wzmocnioną interakcję STING1-CAV2 i przeciążenie Zn²⁺, prowadząc do dysfunkcji mitochondriów i akumulacji ROS. Odkrycia te rozszerzają zrozumienie regulacji ferroptozy i podkreślają potencjał terapeutyczny wykorzystania antybiotyków, takich jak ciprofloksacyna, jako adiuwantów w terapiach przeciwnowotworowych opartych na ferroptozie.

Podsumowanie

Naukowcy odkryli przełomowy mechanizm, w którym ciprofloksacyna (CFX) synergistycznie współdziała z RSL3, zwiększając skuteczność terapii przeciwnowotworowej poprzez indukcję ferroptozy. Badania przeprowadzone na różnych liniach komórek nowotworowych wykazały, że kombinacja CFX-RSL3 działa poprzez szlak topoisomerazy 2β-STING1, prowadząc do obniżenia poziomu TOP2B w mitochondriach. Proces ten uruchamia kaskadę zdarzeń, w tym interakcję między STING1 a kaweoliną-2 (CAV2) oraz zaburzenia homeostazy Zn2+. Mechanizm ten skutkuje dysfunkcją mitochondriów i akumulacją reaktywnych form tlenu, prowadząc do śmierci komórek nowotworowych. Odkrycie to ma szczególne znaczenie kliniczne, gdyż ciprofloksacyna, jako powszechnie stosowany antybiotyk o znanym profilu bezpieczeństwa, może zostać wykorzystana jako adiuwant w terapiach przeciwnowotworowych opartych na ferroptozie, szczególnie w przypadkach oporności na konwencjonalne leczenie.