Synergia nanocząstek srebra z antybiotykami w walce z bakteriami

Jakie podstawy mają badania synergistycznego działania AgNPs?

Badanie to stanowi kompleksową analizę synergistycznego działania nanocząstek srebra (AgNPs) pochodzenia mykologicznego w połączeniu z konwencjonalnymi antybiotykami (ciprofloksacyną i gentamycyną) wobec patogennych szczepów bakteryjnych Staphylococcus aureus ATCC 29213 i Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Naukowcy zastosowali metody mikrorozcieńczeń zgodne z wytycznymi CLSI do oceny skuteczności przeciwdrobnoustrojowej badanych związków.

Populację badawczą stanowiły dwa szczepy bakteryjne: Gram-dodatni S. aureus ATCC 29213 oraz Gram-ujemny P. aeruginosa ATCC 27853. Oba szczepy należą do grupy ESKAPE, odpowiedzialnej za liczne zakażenia szpitalne i charakteryzującej się zdolnością do tworzenia biofilmu. Bakterie te mogą pokrywać powierzchnie urządzeń medycznych, takich jak cewniki, i powodować uporczywe infekcje, gdyż komórki tworzące biofilm mogą wykazywać nawet 1000 razy większą oporność na konwencjonalne środki przeciwdrobnoustrojowe w porównaniu do form planktonowych. Bakterie hodowano w podłożu Mueller-Hinton, a badane nanocząstki srebra pochodziły z płynu pohodowlanego Gloeophyllum striatum DSM 9592.

Czy połączenie nanocząstek z antybiotykami zwiększa skuteczność leczenia?

Wyniki badania wykazały, że jednoczesne zastosowanie AgNPs i testowanych antybiotyków znacząco zwiększa aktywność przeciwbakteryjną w porównaniu do stosowania tych środków osobno. W przypadku S. aureus, AgNPs użyte samodzielnie w stężeniach 0,195 µg/mL, 0,78 µg/mL i 3,125 µg/mL powodowały odpowiednio około 5%, 20% i 40% zahamowania wzrostu bakterii. Jednak połączenie najwyższego stężenia AgNPs z ciprofloksacyną (0,125 µg/mL) zwiększyło skuteczność ponad dwukrotnie, osiągając 95% hamowania wzrostu. Co więcej, kombinacja 3,125 µg/mL AgNPs z 0,125 µg/mL gentamycyny całkowicie zahamowała wzrost S. aureus, zmniejszając efektywną dawkę nanocząstek czterokrotnie.

W przypadku P. aeruginosa, efekt synergistyczny był mniej wyraźny. AgNPs w zakresie stężeń 0,049-0,78 µg/mL powodowały niewielkie zahamowanie wzrostu bakterii. Łączenie AgNPs z ciprofloksacyną (0,0156 µg/mL) skutkowało jedynie nieznacznym zwiększeniem aktywności przeciwbakteryjnej. Natomiast mieszanina 0,39 µg/mL AgNPs z 0,5 µg/mL gentamycyny powodowała około 90% zahamowanie wzrostu P. aeruginosa w porównaniu do kontroli. Warto zauważyć, że w przypadku najwyższego stężenia AgNPs efekt zwiększenia skuteczności przeciwdrobnoustrojowej był słabszy przy zastosowaniu z gentamycyną.

Badacze ocenili również wpływ testowanych związków na tworzenie biofilmu. W przypadku S. aureus, połączenie AgNPs z antybiotykami znacząco zwiększało działanie przeciwbiofilmowe. Przykładowo, mieszanina najniższego testowanego stężenia AgNPs z 0,0313 µg/mL ciprofloksacyny zwiększała aktywność przeciwbiofilmową AgNPs o 50%. Mieszanina 3,125 µg/mL AgNPs z 0,0313 µg/mL gentamycyny hamowała tworzenie biofilmu o około 90%, a przy wyższym stężeniu antybiotyku (0,125 µg/mL) osiągnięto całkowitą inhibicję formowania biofilmu. Natomiast w przypadku P. aeruginosa, zaobserwowano, że subletalne stężenia AgNPs stymulowały tworzenie biofilmu, szczególnie w połączeniu z gentamycyną, gdzie aktywność biofilmowa wzrosła nawet do 200% w porównaniu do kontroli. Najlepszy efekt hamujący zaobserwowano przy mieszaninie 0,049 µg/mL AgNPs z 0,0625 µg/mL ciprofloksacyny, gdzie wzrost biofilmu bakteryjnego został zredukowany do mniej niż 40% kontroli biotycznej.

Jak zmiany w profilach lipidowych wpływają na odporność bakterii?

Analiza profili fosfolipidowych wykazała, że w S. aureus wykryto trzy rodzaje fosfolipidów: fosfatydyloetanolaminy (PE), fosfatydyloglicerole (PG) i lizylo-fosfatydyloglicerole (L-PG), przy czym L-PG stanowiły 67,45% całkowitej zawartości fosfolipidów w próbkach kontrolnych. Dodatek badanych środków przeciwdrobnoustrojowych spowodował zmniejszenie ilości PE, a najistotniejszą zmianę zaobserwowano w przypadku mieszaniny 3,125 µg/mL AgNPs z 0,0078 µg/mL gentamycyny. Ponadto, obecność AgNPs, gentamycyny oraz mieszaniny AgNPs z ciprofloksacyną spowodowała zmniejszenie zawartości PG, przy jednoczesnym wzroście zawartości L-PG, co sugeruje adaptację bakterii do niesprzyjających warunków wzrostu. Zwiększona zawartość L-PG wykazuje działanie ochronne, ponieważ modyfikacja PG lizyną zmniejsza ujemny ładunek błony, co prowadzi do zwiększonego elektrostatycznego odpychania dodatnio naładowanych związków zewnątrzkomórkowych.

W P. aeruginosa wykryto fosfatydylocholiny (PC), PE i PG, z PG jako najliczniejszą frakcją (71,18%). Dodatek 0,78 µg/mL AgNPs nie wpłynął na zawartość PC, ale spowodował niewielki spadek PG i wzrost PE. Antybiotyki stosowane samodzielnie zmniejszały zawartość PC o około 30%, natomiast mieszanina AgNPs z gentamycyną obniżała zawartość PC dwukrotnie i powodowała spadek PG do 65,18%. Zawartość PE wzrosła pod wpływem samych AgNPs i ciprofloksacyny oraz mieszaniny AgNPs z gentamycyną, gdzie zmiana była najbardziej widoczna – zawartość PE zwiększyła się o 30% w porównaniu do kontroli wzrostu.

Badanie wykazało również zmiany w profilu kwasów tłuszczowych bakterii pod wpływem testowanych związków. W S. aureus wykryto 14 typów kwasów tłuszczowych, z dominującymi frakcjami a-15:0 (40,98%) i 18:0 (15,68%). Obecność badanych środków przeciwdrobnoustrojowych spowodowała wzrost ilości kwasu 18:0, przy jednoczesnym spadku zawartości kwasu a-15:0, co wskazuje na zmiany w przepuszczalności i płynności błony komórkowej. Najsilniejszy efekt wykazała gentamycyna stosowana samodzielnie. W P. aeruginosa zidentyfikowano 9 rodzajów kwasów tłuszczowych, z dominującymi klasami 16:0 (40,84%) i 18:1 (36,19%). Najwyraźniejszy efekt badanych związków zaobserwowano w przypadku kwasu 16:1, którego zawartość wzrosła o około 17% w obecności AgNPs połączonych z gentamycyną.

Analiza profilu kwasów tłuszczowych wykazała różnice między badanymi szczepami bakteryjnymi. W S. aureus wszystkie wykryte kwasy tłuszczowe były nasycone, przy czym kwasy rozgałęzione stanowiły około 71% wszystkich kwasów tłuszczowych w kontrolach wzrostu, a kwasy o prostym łańcuchu pozostałe 29%. Kwasy o prostym łańcuchu tworzą grubą dwuwarstwę o niskiej przepuszczalności, podczas gdy kwasy rozgałęzione, w tym formy izo- i anteizo-metylowe, zwiększają płynność błony. Natomiast w P. aeruginosa wykryto zarówno nasycone, jak i nienasycone kwasy tłuszczowe o prostym łańcuchu, a także kwasy rozgałęzione. Kwasy nasycone stanowiły do 55% wszystkich kwasów tłuszczowych, podczas gdy kwasy nienasycone i rozgałęzione stanowiły pozostałą ilość, przy czym kwasy rozgałęzione występowały tylko w śladowych ilościach w kontrolach biotycznych.

Badania wykazały, że struktura profilu kwasów tłuszczowych może być czynnikiem wpływającym na aktywność tworzenia biofilmu. Generalnie komórki bakteryjne tworzące biofilm zawierają większe ilości kwasów nasyconych w porównaniu do komórek planktonowych. Stwierdzono, że niższa płynność błony zwiększa aktywność tworzenia biofilmu, co można uznać za reakcję na stres. Jednakże wyniki dotyczące P. aeruginosa wykazały wzrost płynności błony komórkowej w obecności AgNPs i testowanych antybiotyków. Przypuszcza się, że zjawisko to może negatywnie wpływać na rozwój biofilmu poprzez zakłócanie stabilności formy biofilmu podczas procesu formowania.

Wyniki badania sugerują, że łączenie nanocząstek srebra pochodzenia mykologicznego z konwencjonalnymi antybiotykami może stanowić skuteczną strategię zwiększania aktywności przeciwdrobnoustrojowej i obniżania wymaganych dawek leków. Jednakże efektywność tej metody różni się w zależności od szczepu bakteryjnego, a odkryty stymulujący wpływ subletalnych stężeń AgNPs na tworzenie biofilmu przez P. aeruginosa wymaga dalszej uwagi, gdyż może stanowić dodatkowe zagrożenie w opiece zdrowotnej. Badania sugerują również, że zmiany w profilu lipidowym bakterii mogą dostarczyć cennych informacji o mechanizmach działania AgNPs i antybiotyków oraz o adaptacji bakterii do niekorzystnych warunków środowiskowych.

Podsumowanie

Badanie koncentrowało się na analizie synergistycznego działania nanocząstek srebra (AgNPs) w połączeniu z ciprofloksacyną i gentamycyną przeciwko szczepom bakteryjnym S. aureus i P. aeruginosa. Wykazano, że kombinacja AgNPs z antybiotykami znacząco zwiększa skuteczność przeciwbakteryjną, szczególnie w przypadku S. aureus, gdzie zaobserwowano całkowite zahamowanie wzrostu bakterii. Analiza profili fosfolipidowych i kwasów tłuszczowych ujawniła istotne zmiany w strukturze błon komórkowych bakterii pod wpływem badanych związków. W przypadku S. aureus zaobserwowano wzrost zawartości L-PG, co sugeruje adaptację bakterii do niekorzystnych warunków. U P. aeruginosa odkryto, że subletalne stężenia AgNPs mogą stymulować tworzenie biofilmu, szczególnie w połączeniu z gentamycyną. Badania potwierdziły potencjał kombinacji nanocząstek srebra z antybiotykami jako skutecznej strategii przeciwdrobnoustrojowej, jednak wskazały również na konieczność uwzględnienia różnic w odpowiedzi poszczególnych szczepów bakteryjnych.