Synergia ciprofloksacyny i berberyny w zwalczaniu P. aeruginosa

Jakie metody wykorzystano w badaniu synergii?

Badanie in vitro oceniło synergistyczne działanie ciprofloksacyny i chlorowodorku berberyny przeciwko opornym szczepom Pseudomonas aeruginosa. W eksperymencie wykorzystano standardowy szczep PAO₁ oraz 10 izolatów klinicznych, w tym 5 opornych na karbapenemy (CRPA) i 5 wrażliwych na karbapenemy (CSPA).

Badacze wykorzystali standardowe metody mikrobiologiczne do identyfikacji i charakterystyki izolatów. Szczepy zostały zidentyfikowane fenotypowo na podstawie wzrostu na selektywnym agarze cetrimidowym oraz testów biochemicznych, w tym morfologii kolonii, testów SIM (siarkowodór, indol, ruchliwość), TSI (potrójny cukier-żelazo), ureazy, wykorzystania cytrynianu, produkcji oksydazy i zdolności do wzrostu w temperaturze 42°C. Ostateczne potwierdzenie przeprowadzono poprzez wykrycie genu gyrB metodą PCR. Wszystkie izolaty CRPA wykazywały fenotyp wielolekooporności (MDR), choć pozostawały wrażliwe na aminoglikozydy i gentamycynę, z wyjątkiem jednego izolatu wykazującego oporność na ceftazydym.

Jakie wyniki uzyskano w testach MIC, MBC i biofilmu?

Właściwości przeciwbakteryjne ciprofloksacyny i chlorowodorku berberyny oceniono za pomocą metody mikrorozcieńczeń w bulionie oraz analizy szachownicowej. Dla ciprofloksacyny, wartości MIC (minimalne stężenie hamujące) wynosiły 0,5 μg/ml dla dwóch izolatów CSPA i 64 μg/ml dla dwóch izolatów CRPA. Chlorowodorek berberyny wykazywał MIC ≥ 2375 μg/ml dla wszystkich szczepów. Wartości MBC (minimalne stężenie bakteriobójcze) dla obu związków były co najmniej dwukrotnie wyższe niż odpowiadające im MIC. Co istotne, kombinacja obu związków obniżała MIC przynajmniej dwukrotnie w porównaniu do monoterapii, przy czym stężenia chlorowodorku berberyny w kombinacji były niższe niż jego samodzielne MIC, gdy łączono go z sub-MIC ciprofloksacyny.

Zdolność tworzenia biofilmu oceniono metodą barwienia fioletem krystalicznym. Szczep PAO₁ był silnym producentem biofilmu, wszystkie pięć izolatów CRPA były umiarkowanymi producentami, a cztery izolaty CSPA były słabymi producentami. Ani ciprofloksacyna, ani chlorowodorek berberyny nie eliminowały 24-godzinnych uformowanych biofilmów (MBEC) we wszystkich szczepach. Jednakże oba związki zapobiegały tworzeniu biofilmu (MBIC) przy stężeniach 1× i 0,5× MIC we wszystkich izolatach.

Jak szybko działała kombinacja leków?

Badania kinetyki zabijania przeprowadzono w ciągu 24 godzin. Dla szczepu PAO₁, ciprofloksacyna w stężeniu 1× MIC (0,5 μg/ml) spowodowała znaczącą redukcję o 3 log w ciągu 1 godziny i 5 log w ciągu 4 godzin, bez ponownego wzrostu po 24 godzinach (p < 0,05). Chlorowodorek berberyny w stężeniu 1× MIC (4750 μg/ml) spowodował znaczącą redukcję o 3 log w ciągu 4 godzin i 5 log w ciągu 6 godzin, również bez ponownego wzrostu (p < 0,05). Kombinacja obu związków osiągnęła znaczącą redukcję o 5 log w ciągu 2 godzin i całkowitą eradykację bakterii w ciągu 6 godzin, co było znacząco skuteczniejsze niż każdy związek osobno (p < 0,05). Dla izolatów CRPA, ciprofloksacyna w stężeniu 1× MIC (0,25 μg/ml) dała znaczącą redukcję o 3 log w ciągu 1 godziny, 5 log w ciągu 2 godzin i 6 log w ciągu 4 godzin, bez ponownego wzrostu po 24 godzinach (p < 0,05). Chlorowodorek berberyny w stężeniu 1× MIC wykazywał kinetykę podobną do obserwowanej dla PAO₁. Leczenie kombinacją spowodowało znaczącą redukcję o 3 log w ciągu 1 godziny, znaczącą redukcję o 6 log w ciągu 2 godzin i całkowitą eradykację w ciągu 6 godzin, znacząco przewyższając monoterapię (p < 0,05).

Analiza szachownicowa wykazała synergię między ciprofloksacyną (0-256 μg/ml) a chlorowodorkiem berberyny (0-2375 μg/ml) przeciwko szczepowi PAO₁ z indeksem FIC wynoszącym 0,156, co wskazuje na silną synergię. Dla izolatów CRPA, minimalny indeks FIC wynosił 1,003, przekraczając próg synergii. Pomimo braku synergii w testach szachownicowych dla CRPA, bakteriobójcze działanie kombinacji sugeruje synergizm zależny od czasu, co zaobserwowano w badaniach kinetyki zabijania.

Jakie mechanizmy leżą u podstaw synergii leków?

Wyniki badania wskazują, że chlorowodorek berberyny, naturalnie występujący alkaloid izochinolinowy z minimalnym ryzykiem indukcji oporności, może wzmacniać aktywność ciprofloksacyny. Prawdopodobnym mechanizmem jest hamowanie pomp efflux, szczególnie należących do rodziny Mex (np. MexXY-OprM, MexAB-OprM i MexCD-OprJ), które przyczyniają się do oporności na fluorochinolony poprzez zmniejszenie wewnątrzkomórkowej akumulacji leku.

W odniesieniu do aktywności przeciwbiofilmowej, choć żaden z badanych związków nie był skuteczny w eliminacji uformowanych 24-godzinnych biofilmów, oba były zdolne do hamowania tworzenia biofilmu przy stężeniach MIC i sub-MIC. Ciprofloksacyna znacząco hamowała rozwój biofilmu w szczepach wrażliwych, podczas gdy izolaty CRPA, będące umiarkowanymi producentami biofilmu, wykazywały zmniejszoną odpowiedź, odzwierciedlając zwiększoną odporność tych fenotypów. Chlorowodorek berberyny, mimo braku aktywności eradykacyjnej biofilmu w tym badaniu, skutecznie hamował tworzenie biofilmu poprzez wiele mechanizmów, w tym hamowanie adhezji bakteryjnej i tworzenia mikrokolonii, zakłócanie systemów quorum sensing oraz redukcję produkcji EPS.

Jakie perspektywy kliniczne niesie ze sobą to badanie?

Badanie wykazało, że kombinacja ciprofloksacyny i chlorowodorku berberyny daje znaczące efekty przeciwbakteryjne zarówno wobec wrażliwych, jak i opornych szczepów P. aeruginosa. Ta kombinacja nie tylko zmniejsza efektywną dawkę ciprofloksacyny, potencjalnie obniżając ryzyko działań niepożądanych i minimalizując presję selekcyjną na oporność, ale także skutecznie hamuje tworzenie nowego biofilmu w izolatach wrażliwych i opornych. Chociaż kombinacja nie eliminuje dojrzałych biofilmów, jej zdolność do zapobiegania rozwojowi biofilmu jest obiecująca w leczeniu zakażeń przewlekłych.

Ograniczeniem badania jest stosunkowo mała próba badawcza składająca się z dziesięciu klinicznych izolatów P. aeruginosa wrażliwych i opornych na karbapenemy, wraz z referencyjnym szczepem PAO₁. Większy i bardziej zróżnicowany zestaw izolatów, w tym pochodzących z różnych regionów geograficznych i kontekstów klinicznych, zwiększyłby możliwość uogólnienia i kliniczną istotność wyników. Przyszłe badania powinny dalej badać molekularne mechanizmy leżące u podstaw obserwowanej synergii, szczególnie w izolatach CRPA, aby wyjaśnić potencjalne szlaki modyfikujące oporność. Dodatkowo, ocena skuteczności tej kombinacji w odpowiednich modelach zwierzęcych będzie kluczowa dla jej zastosowania w praktyce klinicznej.

Podsumowanie

Badanie koncentrowało się na ocenie synergistycznego działania ciprofloksacyny i chlorowodorku berberyny przeciwko opornym szczepom Pseudomonas aeruginosa. W eksperymentach wykorzystano standardowy szczep PAO1 oraz 10 izolatów klinicznych. Kombinacja obu związków wykazała znaczącą skuteczność, obniżając minimalne stężenie hamujące (MIC) przynajmniej dwukrotnie w porównaniu do monoterapii. W badaniach kinetyki zabijania, połączenie leków osiągnęło całkowitą eradykację bakterii w ciągu 6 godzin. Choć kombinacja nie eliminowała dojrzałych biofilmów, skutecznie zapobiegała ich tworzeniu. Mechanizm działania opiera się prawdopodobnie na hamowaniu pomp efflux przez berberynę, co zwiększa skuteczność ciprofloksacyny. Wyniki sugerują potencjał terapeutyczny tej kombinacji w leczeniu zakażeń wywołanych przez oporne szczepy P. aeruginosa, przy jednoczesnym zmniejszeniu ryzyka rozwoju oporności.