Synergia CIP i peptydów RWn przełamuje oporność bakterii na antybiotyki

Czy synergia CIP i peptydów RWn otwiera nowe perspektywy leczenia MDR?

W prezentowanym badaniu in vitro oceniono synergistyczne działanie ciprofloksacyny (CIP) w połączeniu z syntetycznymi peptydami przeciwdrobnoustrojowymi (AMPs) bogatymi w argininę i tryptofan, oznaczonymi jako RWn (gdzie n = 4, 6 i 8), przeciwko wielolekoopornym bakteriom Gram-ujemnym.

Badanie przeprowadzono na czterech klinicznie istotnych szczepach bakterii Gram-ujemnych: Escherichia coli (Ec), Klebsiella pneumoniae (Kp), Pseudomonas aeruginosa (Pa) i Acinetobacter baumannii (Ab). Bakterie te stanowią poważne zagrożenie w infekcjach szpitalnych, szczególnie u pacjentów z obniżoną odpornością, przyczyniając się znacząco do globalnego obciążenia związanego z opornością na antybiotyki.

Metodyka obejmowała syntezę peptydów RWn i ich wariantów z proliną (RW4P, RW6P, RW8P, RW6-2P) przy użyciu standardowej syntezy peptydów na fazie stałej (SPPS) z chemią Fmoc. Tożsamość i masa cząsteczkowa peptydów zostały potwierdzone za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF lub ESI-MS, a czystość określono za pomocą analitycznej chromatografii cieczowej wysokiej wydajności (RP-HPLC), potwierdzając czystość ≥95% dla wszystkich partii. Następnie określono minimalne stężenie hamujące (MIC) zarówno dla pojedynczych związków, jak i ich kombinacji, oraz obliczono indeks frakcyjnego stężenia hamującego (FICI) dla oceny synergii. Dodatkowo przeprowadzono testy cytotoksyczności na liniach komórek ludzkich HEK293 i HUVEC, aby określić profil bezpieczeństwa tych kombinacji.

Jakie efekty daje połączenie CIP i peptydów RWn?

Wyniki wykazały, że CIP wykazywał silną aktywność przeciwko Pa (MIC ≤0,25 μg/mL) i umiarkowaną aktywność przeciwko Ec (MIC = 2 μg/mL), ale ograniczoną skuteczność wobec Kp i Ab (MIC >32 μg/mL). Peptydy RWn, z wyjątkiem RW6-2P, wykazywały minimalną wewnętrzną aktywność przeciwbakteryjną przy stężeniach do 32 μg/mL. Natomiast RW6-2P wykazywał znaczącą aktywność przeciwko Kp i Ab (MIC ≤0,25 μg/mL) oraz umiarkowaną aktywność przeciwko Pa (MIC = 2 μg/mL).

Najważniejszym odkryciem było to, że połączenie CIP z peptydami RWn znacząco zwiększało jego aktywność przeciwko wszystkim czterem patogenom, szczególnie wobec szczepów mniej wrażliwych na sam CIP. Na przykład, MIC CIP przeciwko opornemu szczepowi Kp spadło z 32,00 ± 0 do 3,00 ± 1,00 μg/mL (z RW4) i 4,00 ± 0 μg/mL (z RW6 i RW8), co stanowi odpowiednio >10-krotną i >8-krotną redukcję. Podobnie, przeciwko Ab, MIC CIP zostało zredukowane z 32,00 ± 0 do 6,00 ± 2,00 μg/mL w zależności od zastosowanego peptydu.

Stopień synergii był zależny od struktury peptydu. Peptydy bez proliny (RW4, RW6, RW8) generalnie skutkowały niższymi wartościami MIC CIP w porównaniu do ich odpowiedników zawierających pojedynczą prolinę (RW4P, RW6P, RW8P), szczególnie przeciwko Kp i Ab. Wśród peptydów bez proliny, RW6 wykazywał konsekwentnie niskie wartości MIC kombinacji wobec wszystkich testowanych szczepów, chociaż RW4 również wykazywał silne działanie potencjalizujące.

Analiza FICI potwierdziła silną synergię dla CIP w połączeniu z RW6 przeciwko wszystkim szczepom, w tym Kp (FICI = 0,40). RW6-2P również wykazywał synergię ze wszystkimi szczepami. RW4 wykazywał synergię ze wszystkimi czterema szczepami (wartości FICI 0,20-0,50). Kombinacje z wariantami zawierającymi prolinę (RW4P, RW6P i RW8P) generalnie wykazywały addytywność (0,5 < FICI ≤ 1) lub słabszą synergię w porównaniu do ich odpowiedników bez proliny.

Badania cytotoksyczności wykazały, że ani same peptydy, ani ich kombinacje z ciprofloksacyną nie wykazywały znaczącej cytotoksyczności przy najwyższych testowanych stężeniach (CC₅₀ >32 μg/mL). Żywotność komórek pozostawała powyżej 90% dla wszystkich testowanych substancji, co wskazuje na korzystny profil selektywności in vitro dla kombinacji synergistycznych.

Jakie mechanizmy leżą u podstaw synergii CIP i RWn?

Zaproponowany mechanizm synergii opiera się prawdopodobnie na komplementarnych mechanizmach działania. CIP hamuje bakteryjną gyrazę DNA i topoizomerazę IV, zakłócając replikację DNA. Peptydy RWn, szczególnie bogate w argininę i tryptofan, oddziałują z błonami bakteryjnymi i zaburzają ich integralność. To zaburzenie błony prawdopodobnie ułatwia wnikanie CIP do komórki bakteryjnej, zwiększając jego stężenie wewnątrzkomórkowe i przezwyciężając mechanizmy oporności, takie jak pompy efflux, które są powszechnie obserwowane w Kp i Ab.

Szczegółowy mechanizm synergistycznego działania między peptydami RWn a CIP prawdopodobnie obejmuje kilka procesów. Głównym mechanizmem jest prawdopodobnie interakcja kationowych peptydów RWn z ujemnie naładowaną warstwą lipopolisacharydową (LPS) zewnętrznej błony bakterii Gram-ujemnych. Reszty argininy, ze swoimi grupami guanidynowymi, tworzą silne oddziaływania elektrostatyczne z grupami fosforanowymi Lipidu A w LPS, wypierając dwuwartościowe kationy stabilizujące błonę zewnętrzną. Reszty tryptofanu, z ich objętościowymi, amfipatycznymi łańcuchami bocznymi indolu, mają wysokie powinowactwo do regionu międzyfazowego dwuwarstw lipidowych, zakotwiczając peptyd i promując wnikanie do błony i jej dezintegrację.

Ta początkowa interakcja prowadzi prawdopodobnie do zwiększonej przepuszczalności błony, albo poprzez specyficzne mechanizmy, takie jak tworzenie porów toroidalnych lub modele dywanowe, albo poprzez ogólną destabilizację błony, powodując bardziej rozległe uszkodzenia. Ta permeabilizacja pozwala CIP, który normalnie napotyka ograniczone wnikanie przez barierę błony zewnętrznej i aktywne usuwanie przez pompy efflux, na łatwiejsze wnikanie do komórki bakteryjnej i osiągnięcie wyższych stężeń wewnątrzkomórkowych.

Jakie perspektywy rysują się dla tych kombinacji?

Zarówno RW4, jak i RW6 wykazywały silne działanie synergistyczne z ciprofloksacyną, jednak RW4 został wybrany jako najbardziej obiecujący związek wiodący ze względu na jego lepszy profil bezpieczeństwa. Jak wykazano w poprzednio opublikowanych pracach, RW4 nie wykazywał wykrywalnej cytotoksyczności wobec komórek HEK293 ani HUVEC przy stężeniach przekraczających jego przeciwbakteryjne MIC (>32 μg/mL), co zostało potwierdzone również w tym badaniu.

Podsumowując, badanie to demonstruje, że krótkie, bogate w argininę i tryptofan peptydy przeciwdrobnoustrojowe (RWn), szczególnie RW4, synergistycznie zwiększają aktywność przeciwbakteryjną CIP in vitro przeciwko klinicznie istotnym szczepom MDR Ec, Kp, Pa i Ab. Kombinacja CIP i RW4 skutkowała znaczącym obniżeniem MIC CIP, a wartości FICI potwierdziły silną synergię. Chociaż RW6-2P wykazywał dobrą synergię, wyniki podkreślają RW4 jako najlepszy związek do potencjalizacji działania CIP we wszystkich testowanych szczepach. Obserwowana synergia prawdopodobnie wynika z zaburzenia błony bakteryjnej przez RWn, co ułatwia wnikanie CIP i przezwycięża mechanizmy oporności. Co ważne, kombinacje te wykazywały minimalną cytotoksyczność wobec komórek ssaczych przy efektywnych stężeniach. Chociaż dalsze badania in vivo są kluczowe dla oceny farmakokinetyki, skuteczności i bezpieczeństwa, nasze wyniki sugerują, że peptydy RWn, szczególnie RW4, stanowią obiecujące adjuwanty antybiotykowe. Te kombinacje peptyd-antybiotyk oferują potencjalną strategię rewitalizacji skuteczności CIP i rozwiązania krytycznego zagrożenia, jakim są infekcje MDR Gram-ujemne.

Podsumowanie

Badanie wykazało skuteczność synergistycznego działania ciprofloksacyny (CIP) w połączeniu z syntetycznymi peptydami przeciwdrobnoustrojowymi (RWn) w zwalczaniu wielolekoopornych bakterii Gram-ujemnych. Testy przeprowadzono na czterech kluczowych patogenach: E. coli, K. pneumoniae, P. aeruginosa i A. baumannii. Najbardziej obiecujące wyniki uzyskano dla peptydu RW4, który w połączeniu z CIP znacząco zwiększał skuteczność antybiotyku, szczególnie wobec szczepów opornych, przy zachowaniu niskiej cytotoksyczności. Mechanizm działania opiera się na zaburzeniu błony bakteryjnej przez peptydy RWn, co ułatwia wnikanie CIP do komórki. Kombinacja ta może stanowić przełomowe rozwiązanie w walce z opornością na antybiotyki, choć wymaga dalszych badań in vivo.