Przełom w leczeniu uszkodzeń popromiennych: terapia łączona zwiększa szanse przeżycia

Czy promieniowanie to wyzwanie dla zdrowia pacjenta?

Uszkodzenia wywołane promieniowaniem jonizującym stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia, a około 60% takich urazów wynika z detonacji jądrowych i wypadków radiacyjnych. Promieniowanie powoduje niszczące skutki w komórkach, narządach i systemach szczególnie wrażliwych na radiację, takich jak szpik kostny, tkanki przewodu pokarmowego, komórki układu odpornościowego, śledziona, układ rozrodczy oraz mózg. Wcześniejsze badania wykazały, że promieniowanie wywołuje krwotoki mózgowe zarówno wewnętrzne jak i powierzchniowe, zwłaszcza w móżdżku, rdzeniu przedłużonym i moście. Te uszkodzenia wiążą się ze zmniejszoną produkcją ATP oraz spadkiem liczby płytek krwi.

Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) zatwierdziła kilka preparatów do leczenia hematopoetycznego zespołu ostrej choroby popromiennej (H-ARS), w tym Neupogen® (G-CSF), Neulasta® (pegylowany G-CSF lub PEG), Zarxio®, Leukine®, Nplate®, Udenyca®, Stimufend®, Ziextenzo® i Nypozi®. W modelach eksperymentalnych na myszach leczenie G-CSF lub PEG po napromieniowaniu poprawiało przeżywalność o 20-40% w porównaniu do grup kontrolnych.

Jak łączyć terapie by zwiększyć przeżywalność?

Ze względu na ograniczoną skuteczność samej terapii H-ARS, zasugerowano interwencje wspomagające naprawę innych narządów. Wybrano ciprofloksacynę (CIP) – antybiotyk zatwierdzony przez FDA i znajdujący się w Narodowych Strategicznych Zapasach Awaryjnych. Wykazano, że CIP zwiększa przeżywalność zdrowych monocytów z krwi obwodowej po ekspozycji na promieniowanie oraz uwrażliwia komórki nowotworowe na radiację. Ponadto w badaniach przesiewowych wysokiej przepustowości zidentyfikowano CIP jako radioprotektor. Co więcej, połączenie CIP+G-CSF zostało wskazane jako obecnie zalecana standardowa terapia dla hematopoetycznego zespołu ostrej choroby popromiennej. W poprzednich badaniach stwierdzono, że połączenie CIP i PEG zwiększa przeżywalność z 30% do 82% u napromieniowanych myszy.

Promieniowanie powoduje uszkodzenia mózgu i krwotoki, zarówno na powierzchni, jak i wewnątrz tkanki mózgowej. Te uszkodzenia były zmniejszone dzięki terapii skojarzonej PEG i CIP poprzez łagodzenie wywołanego promieniowaniem spadku krążących płytek krwi i mózgowego GFAP oraz wzrostu interleukiny-18 (IL-18), białka dopełniacza C3 i aktywacji p53.

Czy terapia skojarzona naprawia przewód pokarmowy?

W mikrobiomie jelitowym nie zaobserwowano istotnych różnic w alfa-różnorodności po napromieniowaniu, natomiast przesunięcia beta-różnorodności i profile taksonomiczne ujawniły znaczące zmiany w Akkermansia, Bacteroides i Lactobacillus. Ciprofloksacyna ogólnie prowadziła do niższej różnorodności Shannona i przewagi Bacteroides ze wzrostem Akkermansia i Lactobacillus w porównaniu do napromieniowanych myszy otrzymujących placebo. W przeciwieństwie do tego, Neulasta® zwiększała różnorodność Shannona, a do 9 dnia profile taksonomiczne były bardziej zbliżone do grupy kontrolnej niż do grup otrzymujących ciprofloksacynę lub placebo. Terapia łączona Neulasta® i ciprofloksacyny powodowała spadek różnorodności Shannona i prowadziła do unikalnych profili taksonomicznych wkrótce po napromieniowaniu, zbliżając się z czasem do poziomów obserwowanych w grupie kontrolnej, ale z utrzymującym się wzrostem Akkermansia i Bacteroides w porównaniu do samej Neulasty®, chociaż Akkermansia może powodować choroby autoimmunologiczne w zależności od okoliczności.

W niniejszym badaniu sprawdzono, czy terapia łączona CIP i PEG wpływa na uszkodzenia przewodu pokarmowego oraz zbadano możliwe mechanizmy leżące u podstaw tych uszkodzeń, w tym sygnalizację NF-κB, równowagę BAX-Bcl-2, korelację C3-G-CSF i regulację w dół miR-34a. Postawiono hipotezę, że terapia łączona CIP i PEG złagodzi uszkodzenia przewodu pokarmowego wywołane promieniowaniem. Uzyskane dane potwierdzają, że promioniowanie zwiększa uszkodzenia przewodu pokarmowego, a uszkodzenia te są rzeczywiście łagodzone przez terapię skojarzoną CIP i PEG. CIP wzmacnia skuteczność PEG w poprawie przeżywalności po promieniowaniu jonizującym, prawdopodobnie częściowo poprzez łagodzenie uszkodzeń przewodu pokarmowego dzięki regulacji w górę aktywacji AKT i regulacji w dół miR-34a oraz aktywacji IL-18-p53, a także przywróceniu integralności bariery jelitowej.

Jak manifestują się zmiany w modelu eksperymentalnym?

W badaniu wykorzystano myszy B6D2F1/J (samice, 12 tygodni). Zwierzęta podzielono na 8 grup eksperymentalnych (N=6 na grupę na punkt czasowy), obejmujących grupy kontrolne, napromieniowane oraz grupy otrzymujące różne kombinacje leków (CIP, PEG lub CIP+PEG). Myszy poddano napromieniowaniu całego ciała dawką 9,5 Gy (LD50/30) za pomocą promieniowania γ 60Co. CIP podawano doustnie w dawce 90 mg/kg 2 godziny po napromieniowaniu, a następnie raz dziennie przez 14 dni. PEG podawano podskórnie w dawce 1000 μg/kg 24 godziny po napromieniowaniu oraz w dniach 8 i 14. Próbki krwi, śledziony, kości udowej i jelita krętego pobierano od wszystkich myszy w dniach 2, 4, 9 i 15 po napromieniowaniu.

Wyniki badania wykazały, że ekspozycja na promieniowanie powodowała deplecję komórek szpiku kostnego, zmniejszenie masy śledziony i liczby splenocytów oraz uszkodzenia jelita krętego. Leczenie CIP łagodziło deplecję komórek szpiku kostnego w dniu 15, podczas gdy leczenie PEG zaczynało łagodzić ten efekt już w dniu 9. Terapia skojarzona CIP+PEG skutecznie łagodziła wywołaną promieniowaniem deplecję w dniach 9 i 15. Warto zauważyć, że samo leczenie CIP zwiększało liczbę komórek szpiku kostnego u myszy nienapromienowanych, podobnie jak PEG i kombinacja PEG+CIP, co wskazuje na stymulujący wpływ tych leków na układ hematopoetyczny.

W odniesieniu do masy śledziony, samo leczenie CIP nie miało wpływu na zmniejszenie masy tego narządu wywołane promieniowaniem. Natomiast zarówno samo PEG, jak i terapia PEG+CIP łagodziły redukcję masy śledziony, począwszy od dnia 4, co sugeruje, że to PEG przyczynia się do tego efektu łagodzącego. PEG i PEG+CIP również powiększały śledziony u myszy nienapromieniowanych, co dodatkowo potwierdza ten pogląd. Podobnie, w przypadku liczby splenocytów, zarówno PEG, jak i PEG+CIP łagodziły redukcję liczby splenocytów w dniu 15, co wskazuje na dominującą rolę PEG w tym efekcie.

W jelicie krętym, promieniowanie zmniejszało wysokość kosmków o około 27% i zwiększało ich szerokość o 120-149%, co sugeruje obrzęk przewodu pokarmowego. Samo leczenie CIP, ale nie samo PEG, przywracało wysokość kosmków do poziomu wyjściowego. Jednak terapia PEG+CIP przywracała wysokość kosmków szybciej, co sugeruje, że CIP napędza łagodzenie z pewnym udziałem PEG. Ponadto terapia PEG+CIP znacząco łagodziła obrzęk od dnia 4 do dnia 15.

Jakie biomarkery świadczą o regeneracji komórek?

Ekspozycja na promieniowanie zmniejszała głębokość krypt o 22% w dniu 2, która następnie ulegała odbudowie. Leczenie CIP nie wpływało na regenerację głębokości krypt w dniu 2, natomiast PEG lub PEG+CIP zwiększało głębokość o 44% i 53% powyżej odpowiedniego poziomu wyjściowego. Promieniowanie zmniejszało również liczbę krypt w dniu 2, która następnie wracała do normy w dniach 9-15. Leczenie CIP łagodziło redukcję liczby krypt w dniu 2, ale zmniejszało je ponownie w dniu 4, a następnie przywracało w dniach 9 i 15, podczas gdy leczenie PEG przywracało liczbę krypt w dniu 4, zmniejszało je ponownie w dniu 9 i przywracało do poziomu wyjściowego w dniu 15. Jednak podobnie jak w grupie napromieniowanej otrzymującej placebo, w dniach 9 i 15 grupa PEG+CIP wracała do poziomu wyjściowego.

Obserwacje dotyczące wysokości kosmków zostały dodatkowo potwierdzone pomiarami cytruliny w lizatach jelita krętego. W dniu 4 ekspozycja na promieniowanie u myszy otrzymujących placebo, CIP lub PEG+CIP nie powodowała znaczącego zmniejszenia poziomów cytruliny, podczas gdy napromieniowane myszy leczone samym PEG wykazywały znaczący spadek cytruliny. W dniu 9 ekspozycja na promieniowanie u myszy otrzymujących placebo powodowała znaczący spadek poziomów cytruliny, ale poziomy cytruliny u napromieniowanych myszy leczonych CIP, PEG lub kombinacją PEG i CIP nie różniły się od odpowiednich grup kontrolnych, co sugeruje obecność efektów łagodzących. W dniu 15 ekspozycja na promieniowanie u myszy otrzymujących placebo lub CIP nie zmieniała poziomów cytruliny, natomiast samo PEG nie łagodziło spadku wywołanego promieniowaniem. Jednakże terapia skojarzona PEG i CIP u napromieniowanych myszy zwiększała poziomy cytruliny powyżej poziomu myszy z grupy kontrolnej, co sugeruje pełną regenerację.

Czy leczenie chroni bariery i reguluje sygnalizację molekularną?

Istotnym biomarkerem w kontekście uszkodzeń popromiennych jest interleukina-18 (IL-18), która jest konstytutywnie eksprymowana w komórkach niehematopoetycznych, takich jak komórki nabłonka jelitowego, keratynocyty i komórki śródbłonka. IL-18 może modulować zarówno odporność wrodzoną, jak i adaptacyjną, a jej dysregulacja może powodować choroby autoimmunologiczne lub zapalne. Ekspozycja na promieniowanie zmniejszała poziomy IL-18 w dniu 2, ale zwiększała je 2,2-krotnie i 2,3-krotnie odpowiednio w dniach 4 i 9 u zwierząt otrzymujących placebo, po czym poziomy wracały do wartości obserwowanych u kontroli nienapromieniowanych. Leczenie CIP łagodziło zmiany wywołane promieniowaniem w porównaniu do kontroli sham+CIP, począwszy od dnia 2. Leczenie PEG zwiększało poziomy IL-18 w nienapromieniowanych próbkach w dniu 2, podczas gdy kombinacja PEG i promieniowania dawała poziom bardzo zbliżony do kontroli sham+placebo. W dniu 4 leczenie PEG nie zmieniało poziomów w nienapromieniowanych próbkach, ale tylko częściowo łagodziło poziomy po napromieniowaniu. Jednak w dniu 9 leczenie PEG wykazywało pełne łagodzenie poziomów IL-18. W dniu 15 nie było istotnych różnic między próbkami napromieniowanymi a nienapromieniowanymi.

Białko dopełniacza 3 (C3) jest głównie syntetyzowane przez hepatocyty wątrobowe oraz keratynocyty naskórka. Jest kluczowym elementem klasycznej drogi układu dopełniacza, inicjowanej przez obecność kompleksów antygen-przeciwciało. Aktywacja C3 prowadzi do uwolnienia anafilatoksyn (C3a, C4a i C5a), które są ważnymi mediatorami zapalenia, powodując rekrutację i aktywację neutrofili, makrofagów i innych typów komórek. Jego aktywacja prowadzi również do powstania produktów rozkładu (C3b, C3bi i C4b), które działają jako opsoniny, zwiększając fagocytozę i uwalnianie cytokin. Poziomy C3 były dodatnio skorelowane z poziomami IL-18 w dniu 4, natomiast poziomy C3 były ujemnie skorelowane z głębokością krypt w jelicie krętym.

Ważnym aspektem uszkodzeń popromiennych jest naruszenie integralności bariery jelitowej. Wcześniej donoszono, że systemowe zakażenia bakteryjne występowały 6 dni po napromieniowaniu. Uważano, że mikrobiom przewodu pokarmowego i patogeneza toksyczności przewodu pokarmowego wywołanej promieniowaniem były mediowane przez procesy zapalne, zniszczenie bariery nabłonkowej i przepuszczalność jelitową, a także uwalnianie jelitowych cząsteczek immunologicznych. Ekspozycja na promieniowanie zmniejszała ekspresję klaudyny 2, markera połączeń ścisłych. Ani samo CIP, ani samo PEG nie przywracało poziomu klaudyny 2, natomiast terapia PEG+CIP skutecznie przywracała jej poziom. Ekspozycja na promieniowanie zwiększała translokację bakteryjnego DNA. CIP w pełni łagodziło ten wzrost. Zarówno CIP, jak i PEG zwiększały translokację w ich odpowiednich nienapromieniowanych kontrolach otrzymujących placebo, ale PEG robiło to w większym stopniu i nie redukowało translokacji w grupie napromieniowanej do poziomu grupy nienapromieniowanej otrzymującej placebo. Kombinacja PEG+CIP zwiększała poziom wyjściowy u nienapromieniowanych myszy, ale łagodziła go w grupie napromieniowanej do poziomu grupy sham-placebo, potwierdzając zdolność terapii PEG+CIP do utrzymania integralności bariery jelitowej.

Na poziomie molekularnym, promieniowanie zwiększało ekspresję AKT i indukowało aktywację AKT w dniu 4. CIP nie zmieniało aktywacji AKT, ale leczenie PEG lub PEG+CIP dodatkowo zwiększało aktywację AKT. Promieniowanie nie zmieniało znacząco ERK i jego aktywacji. Chociaż CIP zwiększało aktywację ERK, ani PEG, ani PEG+CIP jej nie zmieniało. Promieniowanie nie aktywowało istotnie JNK. Zarówno CIP, jak i PEG+CIP zwiększało aktywację JNK po napromieniowaniu, ale PEG znacząco ją zwiększało. Promieniowanie aktywowało p38, podczas gdy leczenie CIP, PEG lub ich kombinacja nie miało na to wpływu.

Terapia PEG+CIP zmniejszała poziom NF-κB, Bax i Bcl-2 w dniu 4 po napromieniowaniu. Promieniowanie zmniejszało, ale nieistotnie statystycznie, NF-κB, który był znacząco obniżony tylko przez terapię skojarzoną PEG+CIP. Jednak p-NF-κB nie był zmieniany przez promieniowanie niezależnie od leczenia placebo, samym CIP, samym PEG lub kombinacją PEG i CIP. Bax (marker antysurvivalowy) nie był zmieniany przez promieniowanie, chociaż promieniowanie zwiększało Bax w grupie leczonej CIP, ale nie w grupie leczonej PEG, podczas gdy terapia skojarzona PEG+CIP znacząco obniżała Bax. Bcl-2 (marker prosurvivalowy) był zmniejszony przez promieniowanie, co było również obserwowane w przypadku leczenia CIP, PEG lub PEG+CIP, co sugeruje brak apoptozy spowodowanej leczeniem.

Promieniowanie zwiększało ekspresję miR-34a, co było hamowane przez samo PEG lub PEG+CIP. Terapia PEG+CIP łagodziła jego aktywację do poziomu wyjściowego grupy kontrolnej. MiR-34a hamuje produkcję Bcl-2, zwiększając tym samym apoptozę, ale wywołane promieniowaniem zmniejszenie Bcl-2 nie było łagodzone przez leki ani przez leki w terapii skojarzonej. Dlatego zbadano pyroptozę indukowaną przez gasdermin D (GASMD) zależną od kaspazy-1 (casp-1). Aktywowana kaspaza-1 aktywuje GASMD, prowadząc do śmierci komórkowej typu pyroptoza. Promieniowanie zwiększało aktywację kaspazy-1 i GASDM, co było łagodzone przez CIP i PEG+CIP.

Badania immunohistochemiczne potwierdziły, że ekspozycja na promieniowanie zwiększała ekspresję aktywowanego gasderminu D, szczególnie w regionie krypt. Ani samo CIP, ani samo PEG nie redukowało aktywowanego gasderminu D, podczas gdy terapia skojarzona PEG i CIP skutecznie go zmniejszała.

Jakie są dalsze perspektywy terapii popromiennej?

Podsumowując, w obecnym badaniu wykazano łagodzący wpływ terapii skojarzonej (Peg-G-CSF i ciprofloksacyna) na myszy po śmiertelnej dawce 9,5 Gy. Dane sugerują, że łagodzenie deplecji komórek szpiku kostnego, odzyskiwanie masy śledziony, wzrost liczby splenocytów i regeneracja uszkodzeń krypt jelitowych przyczyniają się do ogólnych korzyści dla napromieniowanych myszy leczonych terapią skojarzoną. Wcześniej wysiłki nad opracowaniem tej terapii skojarzonej przeciwko śmiertelnemu promieniowaniu koncentrowały się głównie na 30-dniowej przeżywalności, łagodzeniu krwotoków mózgowych i zwiększeniu β-różnorodności bakterii, szczególnie Akkermansia i Bacteroides w porównaniu do samej Neulasty®.

Skumulowane dowody sugerują, że mikrośrodowisko krypt jelitowych kontroluje komórki macierzyste i determinuje los komórek potomnych w odpowiedzi na uszkodzenia wywołane promieniowaniem, na przykład funkcja śródbłonka reguluje odpowiedzi jelitowe na promieniowanie poprzez kontrolowanie komórek macierzystych krypt. Wyniki obecnego badania dostarczyły dowodów, że 30-dniowe przeżywające napromieniowane myszy leczone terapią skojarzoną PEG i ciprofloksacyny miały poprawioną komórkowość szpiku kostnego, masę śledziony, liczbę splenocytów i normalną głębokość i liczbę krypt jelita krętego oraz zwiększone stężenie cytruliny w jelicie krętym w porównaniu z tymi obserwowanymi u napromieniowanych myszy leczonych placebo, co sugeruje, że ta terapia skojarzona może pomóc w lepszej regeneracji uszkodzeń jelitowych wywołanych promieniowaniem, oprócz jej znaczących łagodzących efektów na krwotoki mózgowe wywołane promieniowaniem i utrzymujące się zwiększenie korzystnej flory bakteryjnej w przewodzie pokarmowym.

Terapia skojarzona PEG+CIP skutecznie łagodzi uszkodzenia szpiku kostnego, śledziony i jelita krętego wywołane promieniowaniem. Efekt łagodzący tej terapii jest związany ze zwiększeniem poziomów G-CSF, które hamuje ekspresję miR-34a, prowadząc prawdopodobnie do zmniejszenia pyroptozy aktywowanej przez gasdermin D. Terapia ta może stanowić obiecującą strategię w leczeniu uszkodzeń popromiennych, zarówno w kontekście ostrych, jak i przewlekłych ekspozycji na promieniowanie.

Ponieważ samice są bardziej odporne na promieniowanie niż samce, należy przeprowadzić badania na samcach myszy. Dodatkowo, inne pozostające pytania do zbadania obejmują: 1. czy antybiotyki inne niż CIP mają taki sam efekt jak CIP, co nie jest znane i powinno być zbadane; oraz 2. czy terapia skojarzona Neulasta™ i CIP będzie skuteczna przeciwko chorobom przewlekłym wywołanym promieniowaniem o niskiej dawce.

Podsumowanie

Przedstawione badanie koncentruje się na skuteczności terapii skojarzonej wykorzystującej ciprofloksacynę (CIP) i pegylowany G-CSF (PEG) w leczeniu uszkodzeń popromiennych. Wyniki wskazują, że kombinacja tych leków znacząco zwiększa przeżywalność po ekspozycji na promieniowanie jonizujące poprzez łagodzenie uszkodzeń w kluczowych narządach. Terapia wykazuje skuteczność w regeneracji szpiku kostnego, przywracaniu masy śledziony oraz naprawie uszkodzeń przewodu pokarmowego. Na poziomie molekularnym, działanie terapii wiąże się z regulacją szlaków sygnałowych, w tym NF-κB, równowagi BAX-Bcl-2 oraz hamowaniem miR-34a. Szczególnie istotne jest przywracanie integralności bariery jelitowej i modulacja mikrobioty. Badanie potwierdza, że terapia skojarzona CIP+PEG może stanowić skuteczną strategię w leczeniu zespołu choroby popromiennej, choć konieczne są dalsze badania uwzględniające różnice płciowe i skuteczność przy przewlekłej ekspozycji na promieniowanie.