Czy mikroorganizmy nasienne kluczowe w bioakumulacji CIP?
Rola mikroorganizmów pochodzących z nasion w regulacji bioakumulacji cyprofloksacyny w warzywach stanowi istotny element w zrozumieniu drogi antybiotyków do łańcucha pokarmowego. Cyprofloksacyna (CIP) jest jednym z najczęściej stosowanych antybiotyków z grupy fluorochinolonów o szerokim spektrum działania. Zanieczyszczenie środowiska tym antybiotykiem budzi rosnące obawy, ponieważ 30-90% podawanych dawek jest uwalniane do środowiska poprzez obornik i ścieki. Poziomy CIP w glebach często przekraczają wartość progową efektu ekotoksycznego (100 μg/kg) ustaloną przez Komitet Sterujący Międzynarodowego Komitetu Harmonizacji Weterynaryjnej.
CIP obecny w glebie jest łatwo absorbowany i akumulowany w warzywach, co może stanowić zagrożenie dla bezpieczeństwa produktów rolnych i zdrowia ludzkiego. Szczególnie narażone są warzywa z rodzaju Brassica, takie jak choy sum (Brassica parachinensis), które wykazują tendencję do bioakumulacji CIP w częściach jadalnych z zanieczyszczonych gleb. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania strategii redukcji akumulacji CIP w warzywach.
W ostatnich latach poszukiwanie i badanie odmian roślin o niskiej akumulacji (LAV) określonych zanieczyszczeń stało się ważną strategią zapewnienia bezpieczeństwa produktów rolnych. Zidentyfikowano różne odmiany LAV odporne na metale ciężkie, jednak odmiany odporne na zanieczyszczenia organiczne, zwłaszcza antybiotyki, były dotychczas słabo zbadane. Wcześniejsze badania ujawniły odmianę choy sum o niskiej akumulacji CIP (LAV), która wykazywała 2,4-3,4 razy niższe stężenia CIP w pędach w porównaniu z odmianą o wysokiej akumulacji (HAV). HAV wykazywała silniejsze pobieranie CIP przez korzenie, translokację CIP z korzenia do pędu oraz większą odporność pędu na toksyczność CIP w porównaniu z LAV, co prowadziło do wyższej akumulacji CIP w jej jadalnych pędach. Jednak mechanizmy leżące u podstaw zróżnicowanej tolerancji na stres CIP i wynikającej z tego akumulacji CIP w pędach między tymi dwiema odmianami pozostawały niejasne.
- HAV (odmiana youqingsijiu) wykazuje 2,4-3,4 razy wyższe stężenia CIP w pędach niż LAV
- HAV charakteryzuje się większą odpornością na toksyczność CIP
- HAV ma wyższą względną liczebność bakterii Bacillus w mikrobiomie nasiennym
- HAV wykazuje 1,2-1,9 razy wyższe stężenia CIP w korzeniach i 1,6-3,2 razy wyższe w pędach
- HAV ma lepszą biomasę (1,01-1,25x) i dłuższe korzenie (1,01-1,67x) niż LAV
Jak wpływa mikrobiota na akumulację CIP w warzywach?
Mikroorganizmy związane z roślinami, zwłaszcza mikrobiota korzeniowa, odgrywają kluczową rolę we wzroście i zdrowiu roślin poprzez modulowanie procesów takich jak absorpcja składników odżywczych, odpowiedź na stres czy rozwój odporności. Badania wykazały również wpływ mikrobioty korzeniowej na pobieranie i akumulację metali ciężkich w roślinach. Endofity korzeniowe mogą wpływać na akumulację metali ciężkich poprzez zmianę fenotypu gospodarza. Natomiast wpływ mikroorganizmów związanych z roślinami na pobieranie i akumulację zanieczyszczeń organicznych był dotychczas słabo poznany. Szczególnie wpływ i mechanizmy mikrobioty pochodzącej z nasion na pobieranie i akumulację zanieczyszczeń organicznych w roślinach pozostają niezbadane, pomimo ich potencjalnego znaczenia w wyjaśnianiu zróżnicowanej tolerancji na zanieczyszczenia i wynikającej z tego akumulacji w pędach między odmianami LAV i HAV.
Wcześniejsze badania ujawniły znaczące różnice w społecznościach mikroorganizmów związanych z korzeniami między HAV i LAV choy sum pod wpływem stresu CIP. Jednak identyfikacja kluczowych zróżnicowanych populacji mikroorganizmów i ich rola w regulacji pobierania i akumulacji CIP, które następnie różnicują stężenia CIP w pędach między tymi dwiema odmianami, pozostawały niejasne.
W prezentowanym badaniu wybrano dwie odmiany choy sum – o niskiej (LAV – youlvcutai) i wysokiej (HAV – youqingsijiu) akumulacji CIP, aby zbadać różnice w mikrobiomie pochodzącym z nasion pod wpływem różnych stężeń CIP (0, 0,2 i 1 mg/L) przy użyciu profilowania genów 16S rRNA i ITS. Badano wpływ mikrobioty pochodzącej z nasion na bioakumulację CIP oraz mechanizmy leżące u podstaw zróżnicowanej bioakumulacji CIP między odmianami. Dodatkowo przeprowadzono eksperymenty inokulacyjne w celu weryfikacji roli kluczowej mikrobioty pochodzącej z nasion w różnicowaniu bioakumulacji CIP w pędach między dwiema odmianami choy sum.
Badania przeprowadzono w ściśle kontrolowanym systemie akszenicznym, który zapewniał, że bakterie rdzeniowe w korzeniach obu odmian pochodziły z endofitów nasion poprzez transmisję pionową. Wykorzystano sterylizowane nasiona obu odmian choy sum, które były uprawiane w sterylnych pudełkach Magenta zawierających sterylny roztwór odżywczy Hoaglanda z różnymi stężeniami CIP. Po 7 dniach uprawy zebrano siewki, aby uzyskać ich korzenie w sterylnych warunkach. Uzyskane korzenie zamrożono natychmiast w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -80°C do określenia mikrobioty pochodzącej z nasion za pomocą sekwencjonowania amplikonów genów 16S rRNA i ITS na platformie Illumina.
Jakie różnice wykazują odmiany choy sum w akumulacji CIP?
Wyniki badań potwierdziły zależną od odmiany akumulację CIP w choy sum. Stężenia CIP w HAV wynosiły 2,2 i 7,0 mg/kg (s.m.) w korzeniach oraz 0,05 i 0,1 mg/kg (s.m.) w pędach w warunkach ekspozycji na 0,2 i 1 mg/L CIP. Wartości te były znacząco wyższe niż w przypadku LAV, z różnicą 1,2-1,9-krotną w korzeniach i 1,6-3,2-krotną w pędach. Odpowiednio, wartości współczynnika koncentracji w korzeniach (RCF) (9,6-17,5) i współczynnika translokacji (TF) (0,016-0,022) były 1,1-1,9 razy wyższe w HAV niż w LAV. HAV miała również wyższą biomasę (1,01-1,25-krotnie) i długość korzeni (1,01-1,67-krotnie) niż LAV, z istotnymi różnicami obserwowanymi w warunkach ekspozycji na 0,2 mg/L CIP. Wynik ten wskazywał, że HAV miała wyższą tolerancję na CIP.
Analiza mikrobioty wykazała, że skład bakterii pochodzących z nasion różnił się znacząco między odmianami HAV i LAV. Większość bakteryjnych OTU (99,8%) można było przypisać do trzech dominujących typów: Proteobacteria (2,2-54,3% względnej liczebności), Firmicutes (45,5-97,8%) i Actinobacteria (0,04-1,6%) w obu odmianach. Odmiana HAV charakteryzowała się wyższą względną liczebnością rodziny Bacillaceae, w tym głównie rodzaju Bacillus, podczas gdy LAV miała wyższą względną liczebność Lachnospiraceae i Enterobacteriaceae.
Zastosowano model zerowy do oceny roli procesów deterministycznych i stochastycznych w formowaniu społeczności bakteryjnej. Stwierdzono, że średnia wartość zmodyfikowanego współczynnika stochastyczności (MST) dla LAV przekraczała 0,5 w grupie kontrolnej, ale spadała poniżej 0,5 w warunkach ekspozycji na CIP o stężeniach 0,2 i 1 mg/L, wskazując na przejście od procesów stochastycznych do deterministycznych. Natomiast HAV wykazywała wartości MST poniżej 0,5 we wszystkich warunkach, sugerując dominującą rolę procesów deterministycznych w formowaniu społeczności bakteryjnej niezależnie od stresu CIP.
Analiza sieci współwystępowania wykazała, że sieci w LAV wykazywały większą złożoność i łączność we wszystkich warunkach, z 1,33-1,45 razy więcej węzłów, 3,87-4,78 razy więcej krawędzi i 2,90-3,50 razy wyższym stopniem w porównaniu do HAV. Z kolei HAV wykazywała większą modularność (0,49-0,609) i pozytywne korelacje (75,3-81,5%) w porównaniu do LAV, która miała niższą modularność (0,458-0,535) i pozytywne korelacje w zakresie od 58,4 do 64,6% we wszystkich warunkach. Wyniki te sugerowały, że społeczność bakterii pochodzących z nasion charakteryzowała się zwiększoną złożonością i łącznością w LAV, podczas gdy była bardziej specyficzna i kooperatywna w HAV.
Analiza korelacji wykazała istotne dodatnie korelacje między stężeniami CIP w pędach, wartościami RCF i TF a względną liczebnością Bacillus. Natomiast zaobserwowano ujemne korelacje między biomasą roślin i długością korzeni a względną liczebnością Lachnospiraceae, a także między RCF i TF a względną liczebnością Enterobacteriaceae. Wyniki te sugerowały, że wysokie wzbogacenie rdzeniowego Bacillus mogło sprzyjać poprawie bioakumulacji CIP w roślinie.
- Produkują wysokie stężenia fitohormonu IAA (82,2 μg/ml), który zwiększa wzrost roślin
- Wytwarzają siderofory poprawiające odporność roślin na stres
- Zwiększają biomasę, długość korzeni i stężenie CIP w roślinach
- Poprawiają aktywność enzymów antyoksydacyjnych (SOD, POD, CAT)
- Ich obecność koreluje dodatnio ze zwiększoną bioakumulacją CIP w częściach jadalnych
Czy inokulacja Bacillus poprawia reakcję roślin na stres CIP?
Aby potwierdzić rolę bakterii Bacillus w akumulacji CIP, przeprowadzono eksperymenty inokulacyjne z wyizolowanym szczepem Bacillus (BpB13). Szczep BpB13, który był wzbogacony w HAV, został pomyślnie wyizolowany. Analiza BLAST ujawniła, że sekwencja genu 16S rRNA BpB13 wykazywała 100% identyczności z sekwencją dominującego Bacillus OTU2. Minimalne stężenie hamujące (MIC) BpB13 przeciwko CIP określono jako 0,25 mg/L.
Po inokulacji BpB13, liczebność Bacillus była ogólnie znacznie wyższa (3,2-krotnie) w HAV niż w LAV pod wpływem stresu CIP. Test chemotaksji wykazał, że wyższy poziom wydzielania kwasu jabłkowego przez HAV mógł być odpowiedzialny za jej wyższe wzbogacenie BpB13. BpB13 znacząco zwiększył biomasę, długość korzeni, stężenie CIP w korzeniach/pędach oraz aktywność enzymów antyoksydacyjnych (np. SOD, POD i CAT) w obu odmianach, jednocześnie zmniejszając zawartość MDA indukowaną przez stres CIP.
W tym badaniu BpB13 zidentyfikowano jako producenta sideroforów, który zwiększał odporność roślin na stres. Ponadto, bakteria ta wydzielała również niezwykle wysokie stężenie fitohormonu IAA (82,2 μg/ml), co sprzyjało wzrostowi roślin. Stężenie IAA produkowane przez BpB13 było 2,6 do 34,8 razy wyższe niż to, co zgłoszono dla innych szczepów Bacillus w poprzednich badaniach. Ta zwiększona produkcja IAA może zwiększać zdolność rośliny gospodarza do przechwytywania zanieczyszczeń organicznych. Rzeczywiście, stwierdzono, że dodanie IAA (100 μg/L) znacząco zwiększyło stężenia CIP w obu odmianach, odpowiednio 1,3-2,3 razy w korzeniach i 3,5-8,3 razy w pędach.
Badanie wykazało, że korzenie HAV mogą wytwarzać wysokie stężenia kwasu maleinowego, który specyficznie wzbogaca Bacillus w ryzosferze poprzez pionowe i poziome drogi transmisji. Wzbogacony Bacillus w korzeniach wydziela IAA i siderofory, które stymulują aktywność antyoksydacyjną w HAV, zwiększając jej tolerancję na stres CIP. Ponadto, wzbogacenie Bacillus sprzyja rozwojowi kooperatywnej społeczności bakterii promujących wzrost roślin głównie poprzez procesy deterministyczne, co znacząco poprawia biomasę, szczególnie długość korzeni w HAV w porównaniu do LAV. Prowadzi to do zwiększonego pobierania przez korzenie i następnie akumulacji CIP.
Wyniki badania rzucają nowe światło na mechanizmy akumulacji zanieczyszczeń organicznych w roślinach poprzez interakcje roślina-mikroorganizmy, wypełniając znaczną lukę w wiedzy dotyczącą wpływu mikrobiomów pochodzących z nasion. Dodatkowo, wyniki wyjaśniają mechanizm leżący u podstaw zróżnicowanej akumulacji CIP w częściach jadalnych wśród różnych odmian roślin z perspektywy bakterii pochodzących z nasion.
Biorąc pod uwagę kluczową rolę mikrobioty związanej z roślinami, szczególnie bakterii pochodzących z nasion, w akumulacji antybiotyków w roślinach, przyszłe badania powinny koncentrować się na potencjale regulacji mikrobiologicznej jako środka łagodzenia zanieczyszczenia rolniczego. Badania mogłyby skupić się na przesiewaniu i hodowli szczepów mikroorganizmów, które mogą skutecznie zmniejszać akumulację antybiotyków w roślinach lub na modyfikowaniu składu społeczności mikrobiologicznych roślin i gleby w celu zminimalizowania akumulacji antybiotyków i innych zanieczyszczeń organicznych w jadalnych tkankach roślinnych.
Warto zauważyć, że Bacillus jest stosowany jako suplement bakterii promujących wzrost roślin w celu poprawy plonów. Biorąc pod uwagę jego wzmacniający wpływ na akumulację CIP w uprawach, dalsze badania nad odpowiednim stosowaniem Bacillus są uzasadnione, aby zapewnić zadowalające zbiory produktów rolnych i niską akumulację zanieczyszczeń w częściach jadalnych upraw.
Podsumowanie
Badania nad bioakumulacją cyprofloksacyny (CIP) w warzywach z rodzaju Brassica wykazały znaczące różnice między odmianami o wysokiej (HAV) i niskiej (LAV) akumulacji tego antybiotyku. Kluczową rolę w tym procesie odgrywają mikroorganizmy pochodzące z nasion, szczególnie bakterie z rodzaju Bacillus, które są bardziej liczne w odmianie HAV. Bakterie te, poprzez produkcję IAA i sideroforów, zwiększają tolerancję roślin na stres CIP oraz wpływają na wzrost i rozwój systemu korzeniowego. HAV charakteryzuje się 2,4-3,4 razy wyższymi stężeniami CIP w pędach w porównaniu z LAV, co jest związane z większą odpornością na toksyczność CIP oraz silniejszym pobieraniem i translokacją antybiotyku. Odkrycia te mają istotne znaczenie dla zrozumienia mechanizmów akumulacji zanieczyszczeń organicznych w roślinach jadalnych i mogą przyczynić się do opracowania skutecznych strategii minimalizujących obecność antybiotyków w produktach rolnych.
Bibliografia
Wang Yi-Ze, Zhao Hai-Ming, Huang Xian-Pei, Zhang Yu, Ye Jin-Cheng, Feng Nai-Xian, Li Yan-Wen, Liu Bai-Lin, Cai Quan-Ying, Xiang Lei, Mo Ce-Hui and Li Qing X.. Variety-dependent seed endophytic bacteria enhance stress tolerance to and bioaccumulation of ciprofloxacin in choy sum (
