Czy mikrochipowa elektroforeza rewolucjonizuje diagnostykę antybiotyków w mleku?
Rozwój mikrofluidyki i elektroforezy kapilarnej doprowadził do powstania mikrochipowej elektroforezy (ME) – kompaktowej technologii, która wymaga minimalnych ilości odczynników i próbek, daje szybkie wyniki i potrzebuje niewiele energii do działania. Ostatnie badania wykazały znaczący postęp w zastosowaniu tej technologii do wykrywania antybiotyków w mleku – istotnego problemu w przemyśle mleczarskim, gdzie obecność antybiotyków stosowanych w leczeniu bydła może stwarzać zagrożenie dla konsumentów i generować straty ekonomiczne.
Naukowcy opracowali niskonapięciowy (poniżej 500 V) system ME oparty na polimerowym mikrochipie z polimetakrylanu metylu (PMMA), zdolny do wykrywania ciprofloksacyny (CPFH) w niefiltrowanym mleku w czasie krótszym niż 10 minut – czyli w czasie porównywalnym z czasem dojenia krowy w nowoczesnej oborze. Dotychczasowe systemy elektroforetyczne wymagały znacznie wyższych napięć (powyżej 2 kV), co stanowiło barierę dla zastosowań terenowych ze względów bezpieczeństwa i logistyki. Dodatkowo, konwencjonalne metody wykrywania antybiotyków w mleku, takie jak Delvotest czy Charm rapid one-step assay, są półilościowe i mają trudności z rozróżnianiem antybiotyków w obrębie tej samej grupy.
Jakie nowatorskie rozwiązania zwiększają efektywność separacji?
Kluczową innowacją przedstawionego systemu jest zastosowanie dodecylosiarczanu sodu (SDS) w buforze tła elektroforetycznego (BGE), co znacząco poprawia przepływ elektroosmotyczny (EOF) w mikrochipie PMMA (ponad 200% poprawa) oraz umożliwia solubilizację tłuszczu mlecznego. Dzięki temu system może pracować bezpośrednio z niefiltrowanym mlekiem, eliminując czasochłonne procedury przygotowawcze, takie jak wirowanie, filtracja czy obróbka chemiczna, które w innych systemach zajmują 2-3 razy więcej czasu niż samo dojenie krowy.
Badacze wprowadzili również udoskonalony model teoretyczny – cross-channel lumped-element model, który lepiej szacuje przyłożone pola elektryczne w porównaniu do tradycyjnego modelu płyt równoległych. Błąd teoretycznego czasu migracji (tm) w nowym modelu wynosi zaledwie 4,68% w porównaniu do 45,0% w tradycyjnym modelu, co świadczy o znacznie lepszym odwzorowaniu rzeczywistych warunków elektroforetycznych.
- Niskie napięcie operacyjne (poniżej 500V) – znacząca poprawa w porównaniu do tradycyjnych systemów (powyżej 2kV)
- Krótki czas analizy – poniżej 10 minut
- Możliwość pracy z niefiltrowanym mlekiem – eliminacja czasochłonnego przygotowania próbek
- Ponad 200% poprawa przepływu elektroosmotycznego dzięki zastosowaniu SDS
- Dwukrotnie krótszy czas migracji i węższa szerokość sygnału w porównaniu do wcześniejszych systemów
Czy dobór materiałów i parametry systemu zapewniają precyzję analizy?
System wykorzystuje fotodiodę SFH 2440 i filtr pasmowy 86-339 starannie dobrane, aby zapobiec pomiarowi emisji fluorescencji białek mleka (340 nm) z diody LED UV 280 nm. Fotodioda SFH 2440 została wybrana ze względu na czułość w zakresie 400-700 nm, podczas gdy filtr pasmowy (440 ± 20 nm) zapewnia, że rejestrowany jest tylko sygnał CPFH. Zastosowanie nanomateriałów (takich jak kropki kwantowe) i środków maskujących w dodatkach do buforu tła elektroforetycznego (takich jak surfaktanty) zmniejsza występowanie wyników fałszywie dodatnich w systemach elektroforetycznych.
W badaniach wykorzystano mikrochipy PMMA z krzyżowymi mikrokanałami o wymiarach 75 μm głębokości na 75 μm szerokości. Eksperymenty przeprowadzono z trzema rodzajami mleka: odtłuszczonym (SM), 1% i pełnym (WM), bez żadnego wstępnego przetwarzania. W systemie zastosowano bufor elektroforetyczny składający się z 50 mM SDS, 5 mM buforu cytrynianowego i 2 mM kwasu octowego, co zapewniło odpowiednie właściwości podwójnej warstwy elektrycznej (EDL) o grubości 1,39 nm.
W porównaniu do wcześniej opublikowanych systemów ME, przedstawione rozwiązanie wykazuje znaczące ulepszenia. Średnie napięcie wyjściowe dla różnych typów mleka jest 1,15-1,54 razy większe, czas migracji jest dwukrotnie krótszy, a szerokość sygnału (FWHM) około dwukrotnie węższa. Dodatkowo, system wykazuje zdolność do wykrywania tłuszczu mlecznego, co mogłoby znaleźć zastosowanie w monitorowaniu zdrowia krów, ponieważ skład tłuszczu mlecznego jest uzależniony od diety, zdrowia i dobrostanu zwierząt.
- Szybka diagnostyka antybiotyków bezpośrednio w gospodarstwach mleczarskich
- Zapobieganie stratom ekonomicznym związanym z odrzucaniem zanieczyszczonych partii mleka
- Zwiększenie bezpieczeństwa produktów mlecznych dla konsumentów
- Potencjał do monitorowania zdrowia krów poprzez analizę tłuszczu mlecznego
- Możliwość osiągnięcia granicy wykrywalności poniżej 0,1 ppm (cel UE) przy zastosowaniu czulszych systemów detekcji
Jak technologia ME wpływa na bezpieczeństwo pacjentów i zwierząt?
Badacze przeprowadzili szczegółową analizę teoretyczną, wykorzystując równania Helmholtza-Smoluchowskiego do obliczenia ruchliwości elektroosmotycznej (μEO) oraz ruchliwości elektroforetycznej (μEP) CPFH. Dzięki temu mogli przewidzieć czas migracji analitu i porównać go z wynikami eksperymentalnymi. Zaproponowany model cross-shaped lumped-element uwzględnia wpływ przekroju mikrochipu i równoważących potencjałów napięcia przyłożonych do studzienek próbki i odpadu podczas procesu separacji, co zapewnia dokładniejsze przewidywanie czasu migracji.
Z klinicznego punktu widzenia, technologia ta oferuje potencjał do szybkiego wykrywania pozostałości antybiotyków w produktach mlecznych, co może przyczynić się do zmniejszenia ekspozycji pacjentów na niepożądane działania antybiotyków oraz ograniczenia rozwoju oporności bakteryjnej. Szacowana granica wykrywalności systemu wynosi 12 ppm, jednak autorzy sugerują, że przy zastosowaniu systemów detekcji o wysokiej czułości, granica ta mogłaby zostać obniżona poniżej 0,1 ppm – celu wyznaczonego przez Unię Europejską.
Przenośny charakter technologii, brak konieczności przygotowania próbek oraz szybki czas analizy sprawiają, że system ten może znaleźć zastosowanie bezpośrednio w gospodarstwach mleczarskich, umożliwiając rolnikom szybkie wykrywanie antybiotyków i podejmowanie decyzji o dalszym przetwarzaniu mleka. Może to zapobiec niepotrzebnym stratom ekonomicznym związanym z odrzucaniem całych partii mleka oraz przyczynić się do zwiększenia bezpieczeństwa produktów mlecznych.
Autorzy podkreślają, że jest to pierwszy opisany w literaturze system ME oparty na PMMA, zdolny do wykrywania CPFH w niefiltrowanym mleku. Technologia ta stanowi wczesny prototyp w kierunku osiągnięcia celu, jakim jest powszechne zastosowanie na farmach, ale już teraz demonstruje istotny postęp w rozwoju przenośnych systemów diagnostycznych do zastosowań w przemyśle spożywczym i monitorowaniu jakości żywności.
Podsumowanie
Naukowcy opracowali innowacyjny system mikrochipowej elektroforezy (ME) do wykrywania antybiotyków w mleku, wykorzystujący niskonapięciowy (poniżej 500 V) mikrochip z polimetakrylanu metylu (PMMA). System umożliwia wykrycie ciprofloksacyny w niefiltrowanym mleku w czasie krótszym niż 10 minut. Kluczową innowacją jest zastosowanie dodecylosiarczanu sodu (SDS) w buforze, co poprawia przepływ elektroosmotyczny i umożliwia bezpośrednią analizę niefiltrowanego mleka. Technologia wykazuje lepsze parametry w porównaniu do wcześniejszych systemów, w tym krótszy czas migracji i węższą szerokość sygnału. System może znaleźć zastosowanie w gospodarstwach mleczarskich do szybkiego wykrywania antybiotyków, zapobiegając stratom ekonomicznym i zwiększając bezpieczeństwo produktów mlecznych.
Bibliografia
Leclerc Camille A., Ty Christopher G. D., Worthington Sean S., Richardson Malley B., AlSawalhi Abdulla K., Wood Larry, Moomand Khalid and Collier Christopher M.. Surfactant‐Based Polymer Microchip Electrophoresis of Ciprofloxacin Hydrochloride Monohydrate in Unfiltered Milk With Fluorescence Detection. Electrophoresis 2025, 46, 143-151. DOI: https://doi.org/10.1002/elps.202400079.
