Kwas azjatycki przywraca skuteczność ciprofloksacyny wobec opornej Shigella

Czy kwas azjatycki może przywrócić skuteczność ciprofloksacyny?

Shigella flexneri, Gram-ujemna bakteria odpowiedzialna za czerwonkę bakteryjną, w 2021 roku była drugą najczęstszą przyczyną zgonów z powodu biegunek wśród dzieci poniżej 5. roku życia na świecie. Światowa Organizacja Zdrowia zaleca leczenie antybiotykami, jednak nadmierne ich stosowanie doprowadziło do gwałtownego wzrostu oporności – w Azji aż 68,7% szczepów wykazuje wielolekooporność (MDR). Szczególnie niepokojące są dane z Indii, gdzie oporność na ciprofloksacynę – lek pierwszego rzutu – sięga 56,2-83,36%.

Zespół badaczy z Indii postanowił sprawdzić, czy kwas azjatycki – pentacykliczny triterpenoid wyizolowany z Centella asiatica – może działać jako adjuwant antybiotykowy, przywracając skuteczność ciprofloksacyny. Wcześniejsze badania wykazały, że związek ten posiada właściwości przeciwbakteryjne, jednak jego potencjał jako wzmacniacza antybiotyków pozostawał niewykorzystany. W obliczu rosnącej oporności i braku szczepionki przeciwko Shigella, poszukiwanie nowych strategii terapeutycznych stało się priorytetem WHO, która w 2024 roku zaklasyfikowała Shigella spp. jako patogen wysokiego priorytetu.

Jak badano synergizm kwasu azjatyckiego z antybiotykami?

Badacze przeprowadzili kompleksową ocenę interakcji kwasu azjatyckiego z panelem antybiotyków obejmującym ciprofloksacynę, kwas nalidyksowy, ampicylinę, chloramfenikol, azytromycynę, tetracyklinę i streptomycynę. Wykorzystano standardowy szczep S. flexneri (Sf2457T) oraz 7 izolatów klinicznych MDR serotypu 2a. Do oceny synergizmu zastosowano metodę szachownicy (checkerboard) z wyznaczeniem wskaźnika FICI (Fractional Inhibitory Concentration Index), gdzie wartość ≤0,5 wskazuje na synergizm.

Mechanizm działania badano wielokierunkowo: test time-kill oceniał kinetykę eliminacji bakterii, test biofilmu z barwieniem fioletowym kryształowym mierzył tworzenie biofilmu, a mikroskopia konfokalna z barwieniem SYTO9/PI wizualizowała integralność błony komórkowej. Ekspresję białek pompy odpływowej AcrA/B analizowano metodą Western blot, a aktywność pompy – testem wypływu bromku etydyny. Badania in vivo przeprowadzono na myszach BALB/c zakażonych dootrzewnowo (10⁸ CFU), z oceną przeżywalności przez 72 godziny i obciążenia bakteryjnego w tkankach.

Jak skuteczna jest kombinacja w eliminacji bakterii?

Test time-kill wykazał, że kombinacja kwasu azjatyckiego (156,25 µg/mL) z ciprofloksacyną (0,0025 µg/mL dla szczepu standardowego lub 2 µg/mL dla szczepu MDR) spowodowała redukcję liczby bakterii o 1,5 log₁₀ CFU/mL po 4 godzinach, 4 log₁₀ po 8 godzinach i 5 log₁₀ po 24 godzinach w porównaniu z samą ciprofloksacyną. Oznacza to 100 000-krotne zmniejszenie liczby żywych bakterii. Co równie istotne, po 20 kolejnych pasażach bakteryjnych MIC ciprofloksacyny wzrosło 64-krotnie przy monoterapii, podczas gdy przy kombinacji pozostało stabilne.

Badania biofilmu pokazały, że kwas azjatycki samodzielnie oraz w połączeniu z ciprofloksacyną znacząco hamował tworzenie biofilmu. Barwienie FITC-konkanawaliną A ujawniło rozluźnienie lub strukturalną dezintegrację warstwy egzopolisacharydów (EPS) przy dawce 312,5 µg/mL kwasu azjatyckiego + 0,00125 µg/mL ciprofloksacyny. Dodatkowo zaobserwowano istotne zmniejszenie zawartości eDNA w matriksie biofilmu, co potwierdzono zarówno mikroskopią konfokalną z barwieniem TOTO-1, jak i elektroforezą żelową.

Jaki mechanizm stoi za działaniem synergistycznym?

Kluczowym mechanizmem okazało się wielokierunkowe uszkodzenie błony komórkowej bakterii. Barwienie Live/Dead (SYTO9/PI) wykazało masowy wzrost wchłaniania jodku propidyny przez bakterie leczone kombinacją, co wskazuje na perforację błony wewnętrznej. Potwierdziły to badania z barwnikiem FM4-64, pokazujące brak fluorescencji u bakterii otrzymujących terapię skojarzoną – znak całkowitej utraty integralności błony. Skaningowa mikroskopia elektronowa ujawniła rozległe uszkodzenia powierzchni bakterii z widocznymi szczątkami lizowanych komórek.

Drugim istotnym mechanizmem była depolaryzacja błony i zahamowanie pompy odpływowej. Barwienie DiBAC4(3) wykazało utratę potencjału błonowego, niezbędnego do funkcjonowania pompy AcrAB-TolC. Western blot potwierdził istotne obniżenie ekspresji białek AcrA i AcrB przy terapii skojarzonej w obu szczepach. Test wypływu bromku etydyny wykazał, że kwas azjatycki hamuje aktywność pompy w szczepie opornym, który nadekspresjonuje geny acrA i acrB. Badania dockingu molekularnego pokazały, że kwas azjatycki wiąże się z miejscem błony proksymalnej (MP) białka AcrA z energią wiązania -7 kcal/mol, porównywalną do znanego inhibitora PAβN (-7,2 kcal/mol).

Czy skuteczność potwierdza się w modelu zwierzęcym?

W modelu myszy BALB/c zakażonych dootrzewnowo S. flexneri, terapia skojarzona (25 mg/kg kwasu azjatyckiego + 1 lub 20 mg/kg ciprofloksacyny) zapewniła 50% przeżywalność po 30 godzinach i 25% po 72 godzinach – znacząco lepiej niż monoterapia którymkolwiek ze związków. W grupie nieleczonej 100% śmiertelność odnotowano już w 19. godzinie po zakażeniu.

Obciążenie bakteryjne w okrężnicy uległo istotnemu zmniejszeniu przy terapii skojarzonej w porównaniu z monoterapią. Podobny efekt zaobserwowano w narządach układowych – wątrobie i śledzionie. Badanie histopatologiczne wykazało, że kombinacja chroniła nabłonek jelitowy przed erozją i fenestracją, podczas gdy u myszy zakażonych i nieleczonych obserwowano rozległe zniszczenie architektury okrężnicy z naciekami zapalnymi błony śluzowej i podśluzowej. Co istotne, podanie kombinacji myszom niezakażonym nie wywołało uszkodzeń tkanek jelitowych, potwierdzając bezpieczeństwo terapii.

Badacze sprawdzili również kombinację kwasu azjatyckiego (25 mg/kg) z kwasem nalidyksowym (5 lub 10 mg/kg) – innym antybiotykiem z grupy chinolonów. Terapia skojarzona istotnie zmniejszyła kolonizację jelitową S. flexneri w porównaniu z monoterapią, potwierdzając, że kwas azjatycki potencjalizuje działanie chinolonów.

Co to oznacza dla walki z opornością bakteryjną?

Odkrycie to ma szczególne znaczenie w kontekście rosnącej oporności S. flexneri na ciprofloksacynę – lek wciąż zalecany przez WHO jako terapia pierwszego rzutu, mimo że w niektórych regionach Azji skuteczność spada poniżej 20%. Kwas azjatycki, jako naturalny triterpenoid dostępny w wielu roślinach leczniczych, może stanowić ekonomiczną i łatwo dostępną opcję terapeutyczną, szczególnie w krajach rozwijających się, gdzie problem wielolekooporności jest najbardziej dotkliwy.

Mechanizm działania kombinacji – jednoczesne uszkodzenie błony, zahamowanie pompy odpływowej i zapobieganie tworzeniu biofilmu – sprawia, że rozwój oporności jest znacznie utrudniony. To kluczowa przewaga nad monoterapią, która w eksperymencie prowadziła do 64-krotnego wzrostu MIC w zaledwie 20 dni. Dodatkowo kwas azjatycki wykazał synergizm z innymi antybiotykami (ampicylina, chloramfenikol), co sugeruje szersze zastosowanie jako uniwersalnego adjuwanta.

Najważniejszą grupą docelową byłyby dzieci poniżej 5. roku życia i pacjenci z obniżoną odpornością, u których zakażenia S. flexneri przebiegają najciężej i wiążą się z najwyższą śmiertelnością. Selektywna toksyczność wobec bakterii przy braku uszkodzenia komórek jelitowych gospodarza czyni tę kombinację szczególnie obiecującą w populacji pediatrycznej.

Jakie są ograniczenia i co wymaga dalszych badań?

Głównym ograniczeniem jest przedkliniczny charakter badań – wszystkie wyniki pochodzą z eksperymentów in vitro i modelu mysiego. Nie ma jeszcze danych dotyczących farmakokinetyki, biodostępności i bezpieczeństwa kwasu azjatyckiego w połączeniu z ciprofloksacyną u ludzi. Konieczne są badania kliniczne fazy I i II, aby ustalić optymalne dawkowanie, ocenić możliwe działania niepożądane i interakcje z innymi lekami.

Badacze testowali ograniczoną liczbę izolatów klinicznych (7 szczepów MDR), co może nie odzwierciedlać pełnej różnorodności genetycznej i fenotypowej S. flexneri występującej globalnie. Niezbędna jest walidacja wyników na szerszym panelu szczepów z różnych regionów geograficznych, szczególnie z obszarów o najwyższej częstości oporności. Ponadto, choć badania wykazały synergizm z chinolonami, mechanizm selektywności wobec tej grupy antybiotyków wymaga głębszego poznania.

Autorzy nie badali długoterminowych efektów terapii skojarzonej, w tym możliwości wpływu na mikrobiotę jelitową gospodarza. Kwas azjatycki wykazuje szerokie spektrum aktywności przeciwbakteryjnej, co może prowadzić do zaburzeń równowagi mikrobioty. Konieczne są badania oceniające wpływ kombinacji na komensalne bakterie jelitowe oraz potencjalne konsekwencje dla funkcji immunologicznych i metabolicznych gospodarza.

Czy kwas azjatycki zmieni przyszłość terapii zakażeń opornych?

Badanie wykazało, że kwas azjatycki skutecznie przywraca aktywność ciprofloksacyny przeciwko wielolekoopornej Shigella flexneri poprzez wielokierunkowy mechanizm: uszkodzenie błony komórkowej, zahamowanie pompy odpływowej AcrAB-TolC i zapobieganie tworzeniu biofilmu. Kombinacja redukuje liczbę bakterii 100 000-krotnie w 24 godziny i całkowicie zapobiega rozwojowi oporności, która przy monoterapii powstaje już po 20 dniach.

W modelu mysim terapia skojarzona znacząco poprawia przeżywalność (50% vs 0% po 30h), zmniejsza obciążenie bakteryjne w jelitach i narządach układowych oraz chroni nabłonek jelitowy przed uszkodzeniem. Co kluczowe, kombinacja wykazuje selektywną toksyczność wobec bakterii, nie uszkadzając komórek gospodarza. Kwas azjatycki potencjalizuje również inne chinolony (kwas nalidyksowy), co sugeruje szerokie zastosowanie jako adjuwanta antybiotykowego.

Mimo obiecujących wyników przedklinicznych, droga do zastosowania klinicznego wymaga przeprowadzenia badań na ludziach, ustalenia optymalnego dawkowania i oceny długoterminowego bezpieczeństwa. Jeśli te etapy zakończą się sukcesem, kombinacja kwasu azjatyckiego z chinolonami może stać się przełomową strategią terapeutyczną w walce z wielolekoopornymi zakażeniami Shigella – szczególnie istotną dla dzieci i pacjentów z obniżoną odpornością w krajach rozwijających się.