Faza wzrostu bakterii kluczem do skuteczności antybiotyków

Czy faza wzrostu bakterii wpływa na skuteczność leczenia fluorochinolonami?

Mechanizmy naprawy DNA u Pseudomonas aeruginosa decydują o przetrwaniu bakterii podczas leczenia fluorochinolonami, ale ich znaczenie zależy od fazy wzrostu bakterii – to kluczowe odkrycie zespołu badaczy, które może pomóc w lepszym zrozumieniu, dlaczego niektóre infekcje są tak trudne do wyleczenia.

Bakteryjna persystencja to zjawisko, w którym podpopulacje bakterii są zabijane wolniej podczas leczenia antybiotykami niż większość populacji. W przeciwieństwie do bakterii opornych, persystory nie wykazują zwiększonych wartości MIC (minimalnego stężenia hamującego), a po usunięciu stresu antybiotykowego i namnożeniu, nowa populacja wykazuje taką samą dynamikę zabijania jak oryginalna kultura. Zjawisko to zaobserwowano u wielu gatunków bakterii, w tym Pseudomonas aeruginosa – częstej przyczyny zakażeń szpitalnych i infekcji u osób z obniżoną odpornością, w tym zakażeń płuc u pacjentów z mukowiscydozą, zakażeń ran oparzeniowych, zakażeń układu moczowego i zapalenia rogówki.

“Nasze badania pokazują, że persystory bakteryjne wykorzystują różne mechanizmy naprawy DNA w zależności od fazy wzrostu, co ma kluczowe znaczenie dla przetrwania podczas terapii fluorochinolonami” – piszą autorzy badania.

Jakie mechanizmy naprawy DNA umożliwiają przetrwanie P. aeruginosa?

Badacze wykazali, że P. aeruginosa wykazuje persystencję wobec ciprofloksacyny (CIP) zarówno podczas leczenia w fazie stacjonarnej, jak i wykładniczej, a ponowny wzrost persystorów prowadzi do powstania populacji o takich samych charakterystykach przeżycia jak pierwotne kultury. Wykorzystując mutanty z delecją genów odpowiedzialnych za rekombinację homologiczną (HR) – ΔrecA i ΔrecB, odkryli, że HR ma istotne znaczenie dla przetrwania P. aeruginosa w fazie stacjonarnej podczas leczenia CIP, ale jest zbędna dla persystorów CIP w kulturach w fazie wykładniczej.

Co ciekawe, u E. coli HR była ważna dla przeżycia zarówno w fazie stacjonarnej, jak i wykładniczej podczas testów persystencji CIP. Znaczenie odpowiedzi SOS (system naprawy DNA uruchamiany w odpowiedzi na uszkodzenia) odzwierciedlało znaczenie HR (P. aeruginosa – faza stacjonarna; E. coli – fazy stacjonarna i wykładnicza), natomiast niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) nie miało znaczenia dla persystorów CIP P. aeruginosa.

Jakie to ma znaczenie kliniczne? Autorzy podkreślają, że “zrozumienie, jak persystory przeżywają leczenie antybiotykami, może wyeliminować persystencję jako przyczynę niepowodzenia leczenia i spowolnić rozwój oporności na antybiotyki”.

Badania wykazały również, że nadekspresja kluczowych białek systemu NHEJ – Ku i LigD – była toksyczna dla P. aeruginosa, co nie było oczekiwane. Aby ocenić ogólność tych odkryć w odniesieniu do innych fluorochinolonów, badacze zastosowali lewofloksacynę (LEV) i zaobserwowali, że HR i odpowiedź SOS były ważne dla persystencji LEV kultur P. aeruginosa w fazie stacjonarnej, ale nie populacji w fazie wykładniczej.

Czy te wyniki można przełożyć na izolaty kliniczne? Naukowcy ocenili to używając szczepu P. aeruginosa MRSN 1612 i odkryli, że recA był ważny dla persystorów CIP w kulturach w fazie stacjonarnej, ale zbędny dla persystorów w populacjach w fazie wykładniczej. To sugeruje, że mechanizmy te mogą być istotne w rzeczywistych warunkach klinicznych.

Warto zauważyć fundamentalne różnice między systemami naprawy DNA u P. aeruginosa i E. coli. U P. aeruginosa regulon SOS składa się tylko z 15 genów, w tym tych kodujących funkcje naprawy uszkodzeń DNA jak recA i imuABC, podczas gdy regulon SOS E. coli jest nawet czterokrotnie większy (do 60 genów) i obejmuje szerszy zakres mechanizmów naprawy uszkodzeń DNA, takich jak uvrA, uvrB, uvrD, ruvA i ruvB. Co więcej, P. aeruginosa zawiera zarówno maszynerię HR, jak i NHEJ, podczas gdy E. coli nie zawiera genów NHEJ.

Dlaczego mechanizmy naprawy DNA nie wspierają persystencji w fazie wykładniczej?

Dlaczego HR i indukcja SOS nie przyczyniają się do poziomu persystorów w kulturach P. aeruginosa w fazie wykładniczej? Badacze sugerują dwa scenariusze: persystory doświadczają uszkodzeń DNA, które są naprawiane przez inne systemy, lub fluorochinolony nie uszkadzają swoich celów i nie powodują uszkodzeń DNA. Może to wynikać z niskiej aktywności ATP, która mogłaby być spowodowana niskimi poziomami ATP, lub aktywnym wypompowywaniem leku, co mogłoby ograniczać interakcje antybiotyk-cel.

Odkrycia te mogą mieć istotne implikacje dla leczenia zakażeń P. aeruginosa. Czy możemy pytać: jak faza wzrostu bakterii wpływa na skuteczność leczenia fluorochinolonami? Jakie strategie terapeutyczne mogą być najbardziej skuteczne przeciwko persystorom w różnych fazach wzrostu?

Zachowane role naprawy DNA w persystencji fluorochinolonów w fazie stacjonarnej sugerują, że HR i odpowiedź SOS mogłyby służyć jako cele terapeutyczne w celu zmniejszenia persystencji i częstości niepowodzeń leczenia fluorochinolonami w różnych bakteriach Gram-ujemnych. Jednocześnie praca ta sygnalizuje znaczenie rozszerzenia badań nad persystorami poza E. coli, ponieważ istotność mechanizmów między gatunkami nie zawsze jest porównywalna.

Jakie eksperymentalne dowody potwierdzają rolę naprawy DNA w persystencji?

Badanie przeprowadzone przez naukowców dostarczyło ważnych informacji na temat roli różnych systemów naprawy DNA w przetrwaniu Pseudomonas aeruginosa podczas leczenia fluorochinolonami. Te odkrycia są szczególnie istotne w kontekście klinicznym, ponieważ P. aeruginosa jest częstą przyczyną trudnych do leczenia zakażeń szpitalnych, zwłaszcza u pacjentów z mukowiscydozą.

Badacze odkryli, że usunięcie genów recA i recB, które są kluczowe dla rekombinacji homologicznej (HR), znacząco zmniejszało przeżywalność persystorów w fazie stacjonarnej, ale nie miało wpływu na bakterie w fazie wykładniczego wzrostu. Podobnie, uniemożliwienie indukcji odpowiedzi SOS poprzez wprowadzenie nierozszczepialnej mutacji białka LexA (lexA(S125A)) również redukowało liczbę persystorów w fazie stacjonarnej, ale nie w fazie wykładniczej.

“Odkryliśmy, że mechanizmy naprawy DNA wykazują różne znaczenie dla przetrwania persystorów P. aeruginosa w zależności od fazy wzrostu bakterii, co jest odkryciem, które może pomóc w opracowaniu lepszych strategii leczenia” – podkreślają autorzy badania.

Co ciekawe, badacze zaobserwowali, że w tych samych warunkach hodowli, P. aeruginosa wytwarza mniej persystorów niż E. coli. Podczas gdy szczep dziki P. aeruginosa wykazywał dwufazowe zabijanie z przeżywalnością około 1% po 7 godzinach leczenia ciprofloksacyną, E. coli wykazywał prawie całkowitą tolerancję, z większością populacji przeżywającą po 7 godzinach leczenia. Jest to godne uwagi, biorąc pod uwagę, że MIC P. aeruginosa jest ponad 10-krotnie wyższe niż E. coli, co ilustruje, że miary oporności (MIC) nie zawsze korelują z poziomami tolerancji.

Badacze sprawdzili również rolę systemu niehomologicznego łączenia końców DNA (NHEJ), który występuje u P. aeruginosa, ale nie u E. coli. Usunięcie genów NHEJ (ku i ligD) nie wpłynęło na poziom persystorów podczas leczenia ciprofloksacyną lub lewofloksacyną w żadnej fazie wzrostu. Co zaskakujące, nadekspresja białek Ku i LigD okazała się toksyczna dla P. aeruginosa.

Aby sprawdzić, czy te obserwacje można uogólnić na inne fluorochinolony, badacze przeprowadzili eksperymenty z lewofloksacyną i zaobserwowali zależności persystencji od genów naprawy DNA analogiczne do tych zaobserwowanych dla ciprofloksacyny. Ponadto, aby ocenić możliwość translacji tych obserwacji na izolaty kliniczne, wykorzystali szczep P. aeruginosa MRSN 1612 i stwierdzili, że recA był ważny dla persystorów ciprofloksacyny w kulturach w fazie stacjonarnej, ale zbędny dla tych w populacjach w fazie wykładniczej.

Jakie mechanizmy tłumaczą obserwowane zjawiska?

Jakie mechanizmy mogą leżeć u podstaw tych obserwacji? Autorzy sugerują, że brak zaangażowania HR i indukcji SOS w persystencję fluorochinolonów w fazie wykładniczej P. aeruginosa może wynikać z dwóch scenariuszy: persystory doświadczają uszkodzeń DNA, które są naprawiane przez inne systemy, lub fluorochinolony nie uszkadzają swoich celów molekularnych.

To drugie mogłoby być spowodowane niską aktywnością ATP, która mogłaby wynikać z niskich poziomów ATP, lub aktywnym wypompowywaniem antybiotyku, co mogłoby ograniczać interakcje antybiotyk-cel. Jak zauważają badacze: “Ze względu na niezwykle niską częstość występowania persystorów fluorochinolonów w rosnących kulturach P. aeruginosa (mniej niż 1 na 100 000), metody obserwacji niskich poziomów ATP lub wypompowywania w persystorach za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej time-lapse lub sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) byłyby niezwykle trudne.”

Jakie są kliniczne implikacje badań nad persystencją?

Dla klinicystów te odkrycia mają istotne implikacje. Po pierwsze, wskazują, że mechanizmy przetrwania persystorów mogą różnić się znacząco między gatunkami bakterii i fazami wzrostu. Po drugie, sugerują, że terapie celujące w systemy naprawy DNA, takie jak HR i odpowiedź SOS, mogłyby być skuteczne w eliminacji persystorów P. aeruginosa w fazie stacjonarnej, ale niekoniecznie w fazie wykładniczej.

W kontekście leczenia zakażeń P. aeruginosa, zwłaszcza u pacjentów z mukowiscydozą, gdzie często występują przewlekłe infekcje z bakteriami w fazie stacjonarnej, strategie terapeutyczne ukierunkowane na hamowanie HR lub odpowiedzi SOS mogłyby potencjalnie zwiększyć skuteczność fluorochinolonów.

Badacze podkreślają również znaczenie tych odkryć dla zrozumienia rozwoju oporności na antybiotyki. Wcześniejsze badania na E. coli wykazały, że persystencja fluorochinolonów może zwiększać rozwój oporności. Podczas leczenia fluorochinolonami, persystory mogą doświadczać uszkodzeń DNA, które są naprawiane przez HR i prowadzą do aktywacji odpowiedzi SOS, co skutkuje zwiększoną ilością polimeraz DNA podatnych na błędy, które mogą wprowadzać mutacje zapewniające oporność.

Podsumowując, badanie to pokazuje, że w P. aeruginosa role różnych systemów naprawy DNA w przeżyciu persystorów fluorochinolonów zależą od fazy wzrostu podczas leczenia. HR i odpowiedź SOS są ważne dla populacji P. aeruginosa w fazie stacjonarnej, aby przetrwać leczenie, co jest podobne do E. coli. Jednak w przeciwieństwie do E. coli, żaden z tych systemów nie przyczynia się do przeżycia persystorów podczas leczenia fluorochinolonami populacji w fazie wykładniczego wzrostu, a NHEJ nie odgrywa roli w przeżyciu persystorów niezależnie od fazy wzrostu podczas leczenia fluorochinolonami. Zachowane role naprawy DNA dla persystencji fluorochinolonów w fazie stacjonarnej sugerują, że HR i odpowiedź SOS mogłyby służyć jako cele terapeutyczne w celu zmniejszenia persystencji i częstości niepowodzeń leczenia fluorochinolonami w różnych bakteriach Gram-ujemnych.

Dla klinicystów oznacza to, że strategie leczenia zakażeń P. aeruginosa powinny uwzględniać fazę wzrostu bakterii, a potencjalne nowe terapie celujące w mechanizmy naprawy DNA mogą być szczególnie skuteczne przeciwko bakteriom w fazie stacjonarnej, które często dominują w przewlekłych infekcjach.

Podsumowanie

Badania nad mechanizmami naprawy DNA u Pseudomonas aeruginosa ujawniły, że ich skuteczność w walce z fluorochinolonami jest ściśle związana z fazą wzrostu bakterii. W fazie stacjonarnej kluczową rolę odgrywają rekombinacja homologiczna (HR) i odpowiedź SOS, podczas gdy w fazie wykładniczej te same mechanizmy tracą na znaczeniu. Jest to istotna różnica w porównaniu do Escherichia coli, gdzie systemy te są ważne w obu fazach wzrostu. System niehomologicznego łączenia końców DNA (NHEJ) okazał się nieistotny dla przetrwania P. aeruginosa w obu fazach. Odkrycia te mają znaczące implikacje kliniczne, sugerując, że skuteczność terapii fluorochinolonami może zależeć od fazy wzrostu bakterii, a strategie terapeutyczne celujące w mechanizmy naprawy DNA mogą być szczególnie efektywne w zwalczaniu bakterii w fazie stacjonarnej, często występującej w przewlekłych infekcjach.