Czy ciprofloksacyna może odzyskać swoją moc?
Badanie opublikowane w czasopiśmie Nature Communications przedstawia analizę eksperymentalną dotyczącą możliwości obniżenia oporności na ciprofloksacynę u Pseudomonas aeruginosa w środowiskach wolnych od antybiotyków. Autorzy przeprowadzili badanie wykorzystując technikę adaptacyjnej ewolucji laboratoryjnej (ALE), skupiając się na szczepach klinicznych posiadających mutacje w genie nfxB, które są odpowiedzialne za nadekspresję pompy MexCD-OprJ i związaną z nią oporność na ciprofloksacynę.
Populacja badana obejmowała izolaty kliniczne P. aeruginosa pochodzące z Centrum Mukowiscydozy w Kopenhadze, należące do sześciu różnych typów klonalnych, z różnymi mutacjami w genie nfxB (4 przesunięcia ramki odczytu i 4 substytucje aminokwasów, w tym 2 kodony stop) i zróżnicowanym poziomem oporności na ciprofloksacynę (0,75–1,5 μg/mL). Badacze analizowali również izogeniczny mutant PA14 nfxB177. Cztery biologiczne replikaty każdego z 8 szczepów klinicznych poddano 15-dniowej ewolucji w dwóch różnych środowiskach wolnych od antybiotyków: standardowym podłożu LB oraz podłożu LB z dodatkiem 10 μg/mL chlorku dekwaliniowego.
- 67% badanych populacji bakterii wykazało znaczący spadek oporności na ciprofloksacynę w środowiskach wolnych od antybiotyków
- W 42 populacjach wartości MIC spadły poniżej klinicznego punktu odcięcia EUCAST (0,5 μg/mL)
- Zaobserwowano 3-16-krotny spadek oporności u większości badanych szczepów klinicznych
- Spadek oporności nastąpił już po około 100 pokoleniach bakterii
- Populacje bakterii odzyskały poziom fitness zbliżony do szczepu rodzicielskiego
Czy kompensacyjne mutacje to nowa nadzieja?
Wyniki badania wykazały znaczący spadek oporności na ciprofloksacynę u 67% populacji (43 z 64) poddanych ewolucji w środowiskach wolnych od antybiotyków. Co istotne, wartości MIC dla 42 z tych populacji spadły poniżej klinicznego punktu odcięcia EUCAST dla ciprofloksacyny (0,5 μg/mL). U szczepów klinicznych 258, 296, 357, 76, 225 i 398 zaobserwowano 3-16-krotny spadek oporności po ewolucji w środowisku bez chlorku dekwaliniowego, a u szczepów 258, 296, 76, 225 i 398 po ewolucji w obecności tego związku. Największy spadek oporności zaobserwowano u szczepów klinicznych 296 i 76 w obu środowiskach, z redukcją MIC do 16-krotności wartości wyjściowej.
Sekwencjonowanie całego genomu populacji wykazujących spadek oporności na ciprofloksacynę ujawniło, że żadna z oryginalnych mutacji nfxB obecnych w szczepach rodzicielskich nie uległa rewersji do sekwencji dzikiego typu. Zamiast tego, spadek oporności był związany z nabyciem mutacji kompensacyjnych, głównie w genach kodujących pompę efflux MexCD-OprJ, w szczególności w genie mexC. Wykryto również delecje (1,4 kb i 7,3 kb) obejmujące gen nfxB i większość mexC u niektórych populacji. Badacze potwierdzili, że mutacje w genie mexC są odpowiedzialne za spadek oporności na ciprofloksacynę i kompensację kosztów fitness, przeprowadzając dodatkowe eksperymenty z podwójnym mutantem nfxB177mexC.
Jak zmiana fitness wpływa na ewolucję oporności?
Analiza względnego fitness wykazała, że mutant nfxB177 charakteryzował się obniżonym fitness w porównaniu do szczepu rodzicielskiego PA14, podczas gdy populacje ewoluujące w środowisku wolnym od antybiotyków odzyskały poziom fitness zbliżony do szczepu rodzicielskiego. Podobne wyniki zaobserwowano u niektórych szczepów klinicznych, szczególnie u szczepu 76, który początkowo wykazywał najwyższy koszt fitness i u którego nastąpiła znacząca poprawa fitness po ewolucji w środowiskach wolnych od antybiotyków. Eksperymenty konkurencyjne potwierdziły, że zarówno szczep dziki PA14, jak i mutant kompensacyjny nfxB177mexC przewyższają szczep nfxB177, natomiast mutant nfxB177mexC nie przewyższa szczepu dzikiego PA14.
Badacze przeanalizowali również, czy populacje powstałe w wyniku 15-dniowej ewolucji w środowiskach wolnych od antybiotyków mogą wykazywać zmiany w poziomie oporności na antybiotyki z różnych rodzin strukturalnych (tobramycyna, aztreonam, fosfomycyna, ceftazydym i imipenem). Chociaż zaobserwowano spadek oporności na ciprofloksacynę w 43 z 64 populacji, wrażliwość na tobramycynę uległa rewersji tylko w 12 populacjach. Zaobserwowano również wzrost oporności na fosfomycynę, aztreonam, ceftazydym i imipenem we wszystkich populacjach należących do izolatu klinicznego 76. Te wyniki odzwierciedlają trudność w znalezieniu solidnego wzorca wrażliwości, który pojawia się w różnych szczepach klinicznych w warunkach braku presji selekcyjnej.
Badanie wskazuje na możliwość ponownego wykorzystania ciprofloksacyny w terapii po okresie ograniczenia jej stosowania. Spadek oporności następuje stosunkowo szybko i jest związany z mutacjami kompensacyjnymi, głównie w genie mexC. Jest to szczególnie istotne w przypadkach, gdy początkowe leczenie nie powiodło się z powodu rozwoju oporności. Jednak przed wdrożeniem takiej strategii terapeutycznej konieczne są dalsze badania, szczególnie w przypadkach oporności związanej z innymi mutacjami niż w genie nfxB.
Czy ograniczenie stosowania antybiotyków otwiera nowe perspektywy?
Badanie to dostarcza dowodów na możliwość szybkiego spadku oporności na ciprofloksacynę u klinicznie istotnych mutantów nfxB w wyniku kompensacyjnej ewolucji w środowiskach wolnych od antybiotyków. Sugeruje to, że ciprofloksacyna mogłaby potencjalnie zostać ponownie wykorzystana w krótkim czasie po ograniczeniu jej stosowania. Autorzy podkreślają jednak, że oporność na ciprofloksacynę może być również związana z innymi mutacjami (np. w mexS i/lub gyrA/B), dlatego konieczna jest dalsza analiza, aby określić, w jakim stopniu możliwe jest zastosowanie strategii terapeutycznej opartej na wykorzystaniu szybkiego spadku oporności na ciprofloksacynę.
Wyniki sugerują również, że po zastosowaniu terapii ciprofloksacyną lub kombinacji ciprofloksacyna-tobramycyna, okresy ograniczenia stosowania antybiotyków mogłyby prowadzić do spadku oporności, szczególnie gdy jest ona spowodowana mutacjami utraty funkcji w genie nfxB. Ta strategia mogłaby zwiększyć prawdopodobieństwo skutecznego ponownego wykorzystania tego samego antybiotyku, nawet jeśli początkowe leczenie nie powiodło się i rozwinęła się oporność.
Autorzy podkreślają, że kompensacyjna ewolucja kosztów fitness związanych z opornością na antybiotyki jest silnie uzależniona od zestawu mutacji obecnych początkowo w każdym szczepie rodzicielskim i jest ważniejsza niż początkowy koszt fitness w ograniczaniu ewolucji kompensacyjnej. Co kluczowe, chociaż spadek oporności zależy od historycznej kontyngencji, zaobserwowano silny spadek oporności na ciprofloksacynę (poniżej klinicznego punktu odcięcia EUCAST) po zaledwie 100 pokoleniach bakterii w 66% populacji ewoluujących w środowiskach wolnych od antybiotyków. Według autorów, jest to najbardziej solidny i szybki spadek oporności zidentyfikowany do tej pory w szczepach klinicznych z powszechnymi mutacjami.
Podsumowanie
Badanie przeprowadzone na szczepach klinicznych Pseudomonas aeruginosa wykazało możliwość znaczącego obniżenia oporności na ciprofloksacynę w środowiskach wolnych od antybiotyków. W 67% badanych populacji bakterii zaobserwowano spadek oporności, przy czym w większości przypadków wartości MIC spadły poniżej klinicznego punktu odcięcia EUCAST. Spadek oporności był związany z pojawieniem się mutacji kompensacyjnych w genach kodujących pompę efflux MexCD-OprJ, szczególnie w genie mexC. Badanie wykazało również, że populacje ewoluujące w środowisku wolnym od antybiotyków odzyskały poziom fitness zbliżony do szczepu rodzicielskiego. Wyniki sugerują, że ograniczenie stosowania antybiotyków może prowadzić do spadku oporności i potencjalnego ponownego wykorzystania ciprofloksacyny w terapii, nawet w przypadkach wcześniejszego rozwoju oporności.
