Mikrosfery z ciprofloxacyną – przełom w kontrolowanym uwalnianiu antybiotyków

Czym jest ciprofloxacyna i jakie są jej wyzwania?

Ciprofloxacyna (CIP) to antybiotyk z grupy fluorochinolonów trzeciej generacji, który wykazuje szerokie spektrum działania przeciwbakteryjnego poprzez hamowanie replikacji DNA patogenów, co ostatecznie prowadzi do śmierci komórek bakteryjnych. Ten lek skutecznie zwalcza różne bakterie, w tym Enterobacter i Pseudomonas aeruginosa, i jest stosowany w leczeniu zakażeń dróg moczowych, rzeżączki, infekcji kości, skóry oraz płuc (zapalenie płuc). Podawanie ciprofloxacyny wymaga dokładnej oceny dawki, starannie dostosowanej do leczonej choroby zakaźnej w celu osiągnięcia najlepszych wyników leczenia.

Zalecana dawka dla skutecznego leczenia infekcji jelitowych wynosi 1 g, podawany dwa razy dziennie przez 7 dni. W przypadku intensywniejszych infekcji, w tym zakażeń kości i stawów, wyższa dawka 1,0-1,5 g jest podawana 2-3 razy dziennie przez 4-6 tygodni lub dłużej. Podobny protokół leczenia 1,0-1,5 g dwa razy dziennie przez 1-2 tygodnie stosuje się w przypadku infekcji skóry i tkanek miękkich oraz zapalenia płuc. Jednak ciprofloxacyna ma krótki okres półtrwania wynoszący zaledwie 3-5 godzin, co wymaga regularnego podawania leku, mogącego prowadzić do różnych działań niepożądanych.

Częste dawkowanie ciprofloxacyny może wywoływać skutki uboczne takie jak nudności, wymioty, biegunka, niestrawność, bóle brzucha i anoreksja. Ponadto mogą wystąpić poważniejsze reakcje niepożądane, w tym fototoksyczność, wysypki skórne, świąd i przekrwienie spojówek. Te problemy terapeutyczne stanowią istotne wyzwanie w skutecznym leczeniu infekcji bakteryjnych i wymagają opracowania systemów dostarczania leków zapewniających przedłużone i kontrolowane uwalnianie substancji czynnej.

Czy mikrosfery mogą przełamać wyzwania tradycyjnego dawkowania?

“Nasze badanie koncentruje się na rozwiązaniu wyzwań związanych z terapią ciprofloxacyną, w tym krótkim okresem półtrwania, zmienną rozpuszczalnością zależną od pH, koniecznością regularnego dawkowania oraz szeregiem działań niepożądanych” – piszą autorzy badania, podkreślając potrzebę opracowania nowego systemu dostarczania leku.

W odpowiedzi na te wyzwania, naukowcy opracowali innowacyjny system dostarczania leku w postaci mikrosfery na bazie polisacharydów – alginianu sodu (Alg) i śluzu z nasion rzeżuchy (CSM). Mikrosfery to stabilne, sferyczne cząsteczki o wymiarach znacznie mniejszych niż 1000 mikrometrów, które dzięki swoim właściwościom takim jak jednolity rozmiar i kształt, duża powierzchnia, biodegradowalność oraz zdolność do przedłużonego uwalniania leków, stanowią doskonałe nośniki dla kontrolowanego uwalniania substancji aktywnych. Te cechy czynią je wzorcowymi dla formulacji o kontrolowanym uwalnianiu, oferując zarówno stabilność, jak i biokompatybilność. Mikrosfery poprawiają jednorodność wchłaniania leku i zmniejszają miejscowe podrażnienia często związane z formulacjami jednodawkowymi. Ponadto, mikrosfery chronią wrażliwe leki, takie jak ciprofloxacyna, przed degradacją żołądkowo-jelitową, zwiększając stabilność i biodostępność.

Polimery polisacharydowe, takie jak alginiany, wyróżniają się wyjątkowymi zaletami, będąc ekonomicznymi, regeneratywnymi i bardziej dostępnymi niż inne makrocząsteczki zazwyczaj używane do przygotowywania mikrosfer. Innym potencjalnym kandydatem jest śluz z nasion rzeżuchy (CSM), naturalny polisacharyd pozyskiwany z nasion Lepidium sativum, znany ze swojej niezwykłej zdolności do tworzenia żelu, wysokiej lepkości i znacznej zdolności zatrzymywania wody. Te cechy tworzą niezwykłe dopasowanie do Na-Alg, szczególnie w ulepszaniu właściwości mechanicznych, przyspieszaniu szybkości żelowania i poprawie profilu uwalniania leku, wywołując bardziej kontrolowany system.

Czy połączenie tych dwóch naturalnych biopolimerów może stanowić przełom w kontrolowanym uwalnianiu antybiotyków? Badacze postawili sobie za cel opracowanie systemu mikrosfer, który zapewniłby kontrolowane uwalnianie ciprofloxacyny, przedłużając jej okres półtrwania i zmniejszając konieczność częstego dawkowania, co mogłoby znacząco poprawić przestrzeganie zaleceń terapeutycznych przez pacjentów.

Jakie metody wykorzystano do formowania mikrosfer?

W badaniu wykorzystano technikę żelowania jonowego do formułowania mikrosfer. Alginian sodu (Alg) był rozpraszany w wodzie destylowanej przy ciągłym mieszaniu utrzymywanym na poziomie 300 obr/min, po czym dodawano śluz z nasion rzeżuchy (CSM) w celu uzyskania jednolitej mieszaniny polimerowej. Ciprofloxacyna była rozpuszczana w 0,1 N roztworze HCL, aby zapewnić całkowitą rozpuszczalność leku przed dodaniem go do mieszaniny polimerowej. Mieszaninę leku i polimeru dodawano powoli, kroplami, przez strzykawkę 24G do 100 ml 7% w/v roztworu chlorku wapnia, co pozwalało na formowanie się mikrosfer. Następnie mikrosfery były oddzielane i rozkładane na bibule filtracyjnej do suszenia przez 24 godziny na powietrzu. Po wysuszeniu mikrosfery przechowywano w szczelnie zamkniętej bursztynowej butelce szklanej.

Formulacje zostały oznaczone jako F1-F4 na podstawie różnych proporcji polimerów alginianu i śluzu z nasion rzeżuchy (CSM), przy zachowaniu stałego stężenia leku. Celem było ocena wpływu składu polimerowego na efektywność enkapsulacji, wielkość cząstek, zachowanie pęcznienia i profil uwalniania leku z mikrosfer.

Co mówią badania fizykochemiczne o strukturze mikrosfer?

Otrzymane mikrosfery poddano szczegółowej analizie przy użyciu różnych technik. Spektroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR) wykazała charakterystyczne przesunięcia pasm absorpcyjnych, potwierdzające skuteczne enkapsulowanie ciprofloxacyny w matrycy polimerowej. Widmo FTIR CSM wykazało rozciąganie (C-O) przy 1120 cm^-1 i rozciąganie (C=O) przy 1639 cm^-1. Piki w regionie 1200-1000 cm^-1 są charakterystyczne dla drgań C-O i C-O-C, potwierdzając skład śluzu.

CIP wykazała swoje charakterystyczne piki przy 1620 cm^-1 i 1695 cm^-1 (C=O), 1139 cm^-1 i 1149 cm^-1 (C-O) oraz 2924 cm^-1 (C-H), z szerokim rozciąganiem (O-H) obserwowanym między 3537 cm^-1 a 3851 cm^-1, wskazującym na silne wiązania wodorowe. Widmo FTIR załadowanych mikrosfer Alg/CSM-CIP wykazało przesunięcie rozciągania C=O z 1469 cm^-1 do 1450 cm^-1 oraz poszerzenie rozciągania O-H z 3689-3996 cm^-1 do 3601-3952 cm^-1, co wskazywało na wiązania kowalencyjne i wodorowe między ciprofloxacyną a matrycą polimerową. Zmniejszona intensywność pików ciprofloxacyny w mikrosferach Alg/CSM załadowanych lekiem potwierdziła jej enkapsulację, prawdopodobnie poprawiając właściwości kontrolowanego uwalniania.

Analiza termiczna przy użyciu termograwimetrii (TGA) i różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC) ujawniła zwiększoną stabilność termiczną ciprofloxacyny po enkapsulacji w mikrosferach. Wszystkie próbki wykazywały wieloetapowe wzorce degradacji, wskazujące na złożone zachowanie termiczne biomateriałów i systemów załadowanych lekiem. CSM (A) wykazał początkową utratę masy poniżej 120°C z powodu parowania wilgoci, a następnie znaczną degradację między 200-350°C, wskazującą na rozkład polisacharydów, z końcową pozostałością około 15%, z degradacją szczytową około 290°C.

CIP (B) wykazała stosunkowo większą stabilność, wykazując znaczną utratę masy w zakresie 320-450°C, z temperaturą degradacji szczytowej bliską 390°C. Niezaładowane mikrosfery (C) wykazały dwuetapowe zachowanie degradacji, z początkową utratą występującą poniżej 120°C z uwolnienia wilgoci. Główna faza degradacji występowała między 220°C a 450°C, osiągając szczyt około 310°C, sugerując zwiększoną stabilność termiczną w stosunku do samego śluzu. Załadowane mikrosfery (Próbka D) wykazały największą stabilność termiczną w porównaniu do wszystkich innych próbek. Początek degradacji został opóźniony do prawie 250°C, ze znaczną utratą masy występującą od 300°C do 500°C, a najwyższa temperatura degradacji przesunęła się do około 370°C. Ta zmiana potwierdziła skuteczną enkapsulację ciprofloxacyny w matrycy polimerowej i wskazuje, że struktura polimerowa zapewnia ochronny wpływ przeciwko degradacji termicznej.

Badania dyfrakcji rentgenowskiej (XRD) wykazały, że charakterystyczne piki ciprofloxacyny przy 8,95°, 12,40° i 15,80° były znacznie zredukowane lub całkowicie zniknęły po enkapsulacji w matrycy Alg/CSM, co wskazuje na zakłócenie pierwotnej struktury krystalicznej leku. Pojawienie się szerokiego piku przy 14,72° mogło wskazywać na częściowe zachowanie struktury lub wkład z matrycy polimerowej. Pik 20,20° został zastąpiony szerszym, o niższej intensywności odbiciem przy 19,26°, sugerując amorficzną dyspersję. Pik 26,60° CIP utrzymał się słabo jako 26,48°, ale ze znacznie zmniejszoną intensywnością, implikując częściową utratę porządku.

Mikroskopia elektronowa skaningowa (SEM) ujawniła, że mikrosfery miały stosunkowo sferyczny kształt z szorstką, pomarszczoną i porowatą powierzchnią, co wskazuje na skuteczną enkapsulację leku. Obrazy (a) i (b) przedstawiają dobrze uformowane kuliste koraliki, prawdopodobnie w wyniku działania żelującego Alg i lepkiej natury CSM. Sferyczna morfologia była korzystna dla kontrolowanego uwalniania leku, promując jednolitą dyfuzję. Obrazy (c), (d) i (e) podkreślają wysoce porowatą i szorstką topologię powierzchni, typową dla polimerowych systemów dostarczania leków. Taka porowatość zwiększa efektywność uwięzienia leku i moduluje profil dyfuzji CIP, wspierając mechanizm przedłużonego uwalniania.

Analiza EDX potwierdziła obecność kluczowych pierwiastków, w tym węgla (31,54%), azotu (2,65%), tlenu (15,59%), sodu (25,03%) i chloru (22,53%), co dalej potwierdza skuteczne uwięzienie ciprofloxacyny w mikrosferach. Wapń (Ca), wykryty na poziomie 2,66%, może być przypisany do pozostałości środków sieciujących lub nieodłącznych zanieczyszczeń w alginianie.

Analiza wielkości cząstek ujawniła znaczące różnice między formulacjami, z rozmiarami wahającymi się od 546 ± 0,18 μm do 772 ± 0,43 μm. Najmniejsze cząstki zaobserwowano w formulacji F4, która miała najwyższe stężenie alginianu. Może to być przypisane szybszemu tempu żelowania i silniejszemu sieciowaniu jonowemu alginianu z chlorkiem wapnia, co skutkuje bardziej zwartymi mikrosferami. Z kolei formulacja F2 wykazała największy rozmiar cząstek, prawdopodobnie ze względu na podwyższoną ilość śluzu z nasion rzeżuchy, który często absorbuje wodę i tworzy większe, luźniejsze struktury.

Efektywność enkapsulacji ciprofloxacyny w Alg/CSM była znacząco wpływana przez skład polimerowy w każdej formulacji. Wartości DEE wahały się od 71,45 ± 0,67% (F2) do 82,81 ± 0,37% (F4). Formulacja F4 wykazała najwyższą efektywność enkapsulacji, prawdopodobnie ze względu na bardziej zwartą i spójną matrycę żelową, która może skutecznie uwięzić cząsteczki leku. Z kolei zwiększony poziom śluzu z nasion rzeżuchy, zaobserwowany w F2, mógł prowadzić do sieci, która jest mniej usieciowana i bardziej porowata, ułatwiając pewne wyciekanie leku podczas procesu produkcji.

Wydajność procentowa mikrosfer Alg/CSM enkapsulujących CIP różniła się znacznie między formulacjami, pod wpływem stosunku polimerowego alginianu (Alg) i śluzu z nasion rzeżuchy (CSM). Wydajność wahała się między 78,87 ± 0,16% a 93,96 ± 0,21%. Największą wydajność zaobserwowano w formulacji F4, ze względu na zwiększoną zdolność tworzenia żelu i skuteczność sieciowania alginianu w obecności jonów wapnia, co skutkuje silniejszym tworzeniem mikrosfer i zmniejszoną utratą materiału.

Jak zachowuje się lek w warunkach in vitro i jakie ma działanie antybakteryjne?

Jednym z najważniejszych aspektów badania było określenie profilu pęcznienia i uwalniania leku. Zachowanie pęcznienia mikrosfer było silnie zależne od pH środowiska. Ponieważ mikrosfery zawierały Alg i CSM, Alg jest polimerem polianionowym składającym się z kwasów guluronowego (G) i mannuronowego (M) z grupami karboksylowymi (-COO^–). Przy kwaśnym pH grupa karboksylowa protonuje do -COOH, zmniejszając ładunek ujemny, co prowadzi do słabego pęcznienia mikrosfer. CSM jest również polisacharydem z grupami hydroksylowymi i karboksylowymi; relaksacja łańcucha i hydratacja były zminimalizowane, i obserwowano słabe pęcznienie przy pH 1,2.

Przy zasadowym pH 6,8, sformułowane mikrosfery wykazały znaczne pęcznienie; grupy kwasu karboksylowego zarówno Alg, jak i CSM deprotonowały do (-COO^–), prowadząc do odpychania elektrostatycznego między łańcuchami polimerowymi, co prowadziło do penetracji wody i relaksacji polimeru, skutkując wyższym pęcznieniem. CSM jest również wysoce hydrofilowy ze względu na swoje grupy hydroksylowe i kwasy uronowe, umożliwiając absorpcję wody. Razem tworzą matrycę hydrożelową o zrównoważonej elastyczności i zdolności pochłaniania wody, z wysokim pęcznieniem po 12 godzinach. Ich połączona hydrofilowa natura skutkuje wyraźnym wzrostem indeksu pęcznienia do 800-900%, który był utrzymywany przez kilka godzin przed stopniowym spadkiem z powodu relaksacji strukturalnej i potencjalnego rozpadu matrycy.

Profile uwalniania leku in vitro wszystkich formulacji (F1-F4) były oceniane przy pH 6.8 przez 24 godziny, symulując warunki jelitowe. Wszystkie formulacje wykazywały zachowanie przedłużonego uwalniania, charakteryzujące się początkową fazą opóźnienia, a następnie stopniowym i progresywnym wzrostem uwalniania leku w czasie. Wśród formulacji, F4 demonstrowała najbardziej przedłużone skumulowane uwalnianie leku, osiągając około 92% uwolnienia po 24 godzinach, wskazując, że F4 ma bardziej gęsty system matrycy, choć F3 wykazała nieco umiarkowane uwolnienie około 95% po 24 godzinach. W przeciwieństwie do tego, F1 i F2 wykazały stosunkowo szybkie tempo uwalniania, szczególnie podczas początkowych 06-14 godzin, wskazując na wyższą porowatość, pokazując szybszą dyfuzję leku.

Dane wskazują, że formulowane mikrosfery następowały model Korsmeyer-Peppas (R² = 0,9816-0,9972), co sugeruje mechanizm dyfuzji nie-Ficka (anomalny), rządzony kombinacją dyfuzji leku i relaksacji/erozji matrycy. Ta obserwacja podkreśla znaczący wpływ składu polimerowego, szczególnie stosunku Alg do CSM, na modulację uwalniania ciprofloxacyny.

Aktywność przeciwbakteryjna mikrosfer została potwierdzona w testach przeciwko różnym szczepom bakterii, w tym Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Escherichia coli i Pseudomonas aeruginosa. Dane wyraźnie pokazują, że D, czysta ciprofloxacyna, wywierała najsilniejszy efekt hamujący na wszystkie cztery szczepy. Strefa inhibicji dla D była najwyższa dla E. coli (31 mm), a następnie blisko dla S. aureus (40 mm), L. monocytogenes (30 mm) i P. aeruginosa (23 mm), wskazując na jej potencjał przeciwko zarówno organizmom Gram-dodatnim, jak i Gram-ujemnym.

Formulacja rynkowa (N) wykazała aktywność przeciwbakteryjną prawie porównywalną do czystej CIP. Wytworzyła identyczne strefy inhibicji (40 mm) przeciwko S. aureus i wykazała tylko nieco niższą aktywność przeciwko E. coli (30 mm), L. monocytogenes (28 mm) i P. aeruginosa (25 mm). Nieznaczne zmniejszenie aktywności w porównaniu do D może być przypisane obecności excipientów formulacyjnych, modyfikatorów pH lub stabilizatorów w produkcie komercyjnym, które mogą wpływać na uwalnianie lub dyfuzję leku podczas testu dyfuzji agarowej.

W przeciwieństwie do tego, F, zoptymalizowana formulacja, wykazała znacznie niższą aktywność przeciwdrobnoustrojową przeciwko wszystkim testowanym szczepom. Strefy inhibicji były znacznie zredukowane: 35 mm dla S. aureus, 22 mm dla L. monocytogenes, 21 mm dla E. coli i tylko 11 mm dla P. aeruginosa. Ta zmniejszona aktywność jest najprawdopodobniej spowodowana enkapsulacją leku w ramach polimerowych, takich jak Alg lub śluz, które ograniczają natychmiastowe uwalnianie leku do otaczającego medium. Niższe strefy inhibicji nie wskazują zatem koniecznie na zmniejszoną skuteczność, ale raczej na wolniejsze uwalnianie leku, co może być korzystne terapeutycznie poprzez utrzymanie przedłużonych stężeń w osoczu lub tkankach, zmniejszenie częstotliwości dawkowania i poprawę przestrzegania zaleceń przez pacjentów.

Jakie znaczenie mają wyniki badań dla praktyki klinicznej?

Jakie znaczenie kliniczne mają te wyniki? Opracowany system mikrosfer może znacząco zmienić sposób podawania ciprofloxacyny pacjentom. Przedłużone uwalnianie leku może zmniejszyć częstotliwość dawkowania z kilku razy dziennie do potencjalnie raz dziennie, co znacząco poprawiłoby przestrzeganie zaleceń przez pacjentów. Ponadto, kontrolowane uwalnianie może zmniejszyć występowanie działań niepożądanych związanych z gwałtownymi wahaniami stężenia leku w organizmie.

Podsumowując, badanie to przedstawia nowatorskie podejście do przedłużonego dostarczania antybiotyków poprzez opracowanie mikrosfer z ciprofloxacyną przy użyciu synergistycznej mieszanki alginianu i śluzu z nasion rzeżuchy. Mikrosfery wykazały nie tylko integralność strukturalną i jednolitą morfologię, ale także kompatybilność termiczną i fizykochemiczną. Rozkład wielkości cząstek pozostał w optymalnym zakresie dla zastosowań kontrolowanego dostarczania, wspierając przedłużoną rezydencję leku. Kinetyka uwalniania mikrosfer demonstrowała wyraźny profil przedłużonego uwalniania nie-Ficka, wraz ze znaczącą aktywnością przeciwbakteryjną. Łącznie te ustalenia pozycjonują matrycę Alg-CSM jako biokompatybilny, przyjazny dla środowiska i efektywny nośnik do przedłużonego dostarczania ciprofloxacyny.

Podsumowanie

Badanie przedstawia innowacyjne rozwiązanie problemów związanych z tradycyjnym dawkowaniem ciprofloxacyny poprzez opracowanie systemu mikrosfer opartego na naturalnych polimerach – alginianie sodu i śluzie z nasion rzeżuchy. Mikrosfery charakteryzują się sferycznym kształtem, porowatą powierzchnią i rozmiarem od 546 do 772 mikrometrów. Wykazują wysoką efektywność enkapsulacji leku (do 82,81%) oraz wydajność produkcji sięgającą 93,96%. Badania fizykochemiczne potwierdziły skuteczną enkapsulację ciprofloxacyny, zwiększoną stabilność termiczną oraz kontrolowane uwalnianie leku w warunkach fizjologicznych. System wykazuje przedłużone uwalnianie przez 24 godziny, z najlepszymi wynikami dla formulacji F4 (92% uwolnienia). Zachowana została aktywność przeciwbakteryjna wobec różnych patogenów, mimo wolniejszego uwalniania leku. Opracowany system może znacząco poprawić skuteczność terapii poprzez zmniejszenie częstotliwości dawkowania i ograniczenie działań niepożądanych.