Salmonella staje się odporna na antybiotyki – nowe odkrycia dają nadzieję

Czy Salmonella staje się niepokonana?

Bakterie Salmonella stanowią powszechny patogen przenoszony przez żywność, który może infekować ludzi poprzez spożycie skażonych produktów pochodzenia zwierzęcego. Badania wykazały istotną korelację genetyczną między izolatami Salmonella z ludzkich zakażeń jelitowych a izolatami pochodzenia ptasiego, podkreślając krytyczny związek między ludzkimi infekcjami Salmonella a łańcuchem dostaw żywności. Globalnie, nietyfoidalna Salmonella powoduje około 95 milionów przypadków chorób przenoszonych przez żywność i 150 000 zgonów rocznie. Salmonella Typhimurium jest jednym z najczęstszych serotypów nietyfoidalnej Salmonella i jest często wykrywana u zwierząt hodowlanych, drobiu i produktów zwierzęcych w wielu krajach. Obecnie fluorochinolony są jednymi z leków pierwszego wyboru w leczeniu zakażeń Salmonella. Jednak 29,2% S. Typhimurium izolowanych od pacjentów z biegunką i klinicznie podejrzewanych zakażeń Salmonella wykazuje oporność na ciprofloksacynę, lek pierwszego rzutu. Powszechne występowanie opornych na fluorochinolony bakterii Salmonella skłoniło Światową Organizację Zdrowia (WHO) do sklasyfikowania tych opornych bakterii jako jednego z patogenów priorytetowych.

Mechanizmy bakteryjnej oporności na chinolony obejmują mutacje w genach gyrA, gyrB, parC i parE w obrębie regionu determinującego oporność na chinolony (QRDR), a także ekspresję genów oporności na chinolony przenoszonej przez plazmidy (PMQR). Badania wykazały, że pojedyncza mutacja w GyrA, prowadząca do zastąpienia proliny (Pro) w pozycji 864 seryną (Ser), może być ściśle związana z opornością na fluorochinolony. Analiza mutacji QRDR w izolatach Salmonella enterica z całego świata wykazała, że pojedyncze mutacje były powszechne w pozycji 83 lub 87 w GyrA. Jednak mutacje w podjednostkach GyrB i ParE były rzadko obserwowane w izolatach Salmonella enterica. Pod wpływem presji przeciwdrobnoustrojowej, rozwój oporności u bakterii nie jest przypisywany wyłącznie interakcjom lek-cel, ale obejmuje również zmiany zachodzące w wyniku zaburzeń mikrobioty, procesów metabolicznych lub zmian w wirulencji bakterii. Dlatego zrozumienie zmian indukowanych przez antybiotyki w bakteryjnych procesach metabolicznych, lokalnych metabolitach i wpływie tych metabolitów na dynamikę oporności jest kluczowe dla ograniczenia rozprzestrzeniania się oporności.

Obecnie technologie transkryptomiczne i metabolomiczne są szeroko stosowane do badania bakteryjnych mechanizmów leżących u podstaw oporności na leki. Połączone zastosowanie technologii multi-omicznych dostarcza uzupełniających się i potwierdzających informacji zarówno na poziomie genów, jak i metabolitów. Ostatnie badania coraz częściej koncentrują się na związku między profilami metabolicznymi opornych na leki bakterii Salmonella a mechanizmami oporności na antybiotyki. Jedno z badań, wykorzystujące nietargowane podejście metabolomiczne, badało mechanizmy oporności na gentamycynę u Salmonella i znalazło związki z zaburzeniami w centralnym metabolizmie węgla oraz zmianami w szlakach metabolicznych, w tym związanych z aminokwasami, nukleotydami, witaminami i kofaktorami. Dlatego analiza ekspresji genów, białek i metabolitów w różnych punktach czasowych przy użyciu technik omicznych może zapewnić kompleksowe zrozumienie odpowiedzi bakterii na różne leki przeciwdrobnoustrojowe. Jednakże, ze względu na brak badań transkryptomicznych i metabolomicznych nad opornymi na ciprofloksacynę bakteriami Salmonella, związane z tym zmiany w metabolomie i ekspresji genów pozostają w dużej mierze niezbadane.

Jak przebiega ewolucja oporności in vitro?

W porównaniu z metodami krótkoterminowej indukcji stosowanymi w poprzednich badaniach, to badanie wykorzystało ciprofloksacynę do przeprowadzenia ciągłej 58-dniowej indukcji in vitro S. Typhimurium. Systematycznie monitorowano dynamiczne przejście szczepu bakteryjnego od wrażliwości do niskiego poziomu oporności, a następnie do wysokiego poziomu oporności. Następnie przeprowadzono zintegrowane analizy transkryptomiczne i metabolomiczne, zarówno indywidualnie, jak i w połączeniu, w celu identyfikacji kluczowych genów i zmian metabolicznych związanych z opornością na leki, a także walidacji wpływu kluczowych metabolitów na interakcje antybiotyków. Badanie to dostarcza teoretycznych podstaw do opracowania nowych strategii opóźniania lub łagodzenia oporności na leki.

Bakteria oporna na ciprofloksacynę H1 (MIC = 2 μg/mL) została uzyskana z wrażliwego szczepu rodzicielskiego S. Typhimurium CICC10420 (M) poprzez seryjne pasażowanie na płytkach agarowych ze stopniowo zwiększającymi się stężeniami leku. Po dalszym zwiększeniu stężenia leku, wzrost bakterii ustał. W porównaniu z wrażliwym szczepem M, szczep H1 wykazywał zwiększone wartości MIC dla 16 leków, przy czym wartości MIC ciprofloksacyny, ofloksacyny, ceftriaksonu, ampicyliny i tetracykliny osiągnęły lub przekroczyły progi oporności. Wartości MIC szczepu H1 dla różnych antybiotyków wzrosły co najmniej dwukrotnie, a w niektórych przypadkach rzeczywista zmiana wielokrotności była jeszcze wyższa, wskazując na istotne zwiększenie oporności na leki. Po 5 dniach pasażowania szczepu H1 przez medium bez leku, oporność szczepu H1 była stabilna. W szczepie H1 zidentyfikowano mutację (A→C) w pozycji 1398 w genie gyrB.

Czy fenotypowe zmiany potwierdzają mechanizmy oporności?

Nie zaobserwowano istotnych różnic w krzywej wzrostu szczepu H1 w porównaniu do szczepu M. Jednakże, szczep H1 wykazał zwiększoną zdolność do tworzenia biofilmu i zmniejszoną przepuszczalność błony komórkowej, co może przyczyniać się do zmniejszonej wrażliwości na wiele leków. Dodatkowo, ruchliwość szczepu H1 była wyraźnie zmniejszona, a mikroskopia elektronowa transmisyjna wykazała, że w przeciwieństwie do szczepu M, który posiada wici periplazmatyczne, większość komórek szczepu H1 utraciła swoje wici. Ta zmiana strukturalna może częściowo wyjaśniać obserwowane zmniejszenie ruchliwości.

Co mówią zmiany transkryptomiczne o oporności?

Profilowanie transkrypcyjne wrażliwego szczepu rodzicielskiego M i indukowanego opornego szczepu H1 przeprowadzono w celu wyjaśnienia podstawowych molekularnych mechanizmów oporności. Analiza mapy cieplnej wykazała silną korelację (bliską 1) między trzema biologicznymi powtórzeniami obu szczepów, wskazując na solidną wewnątrzgrupową powtarzalność. Łącznie 535 genów było upregulowanych, podczas gdy 618 genów było downregulowanych w szczepie H1 w porównaniu do szczepu M.

Upregulowane geny w szczepie H1 były głównie związane ze szlakiem pentozo-fosforanowym i opornością na β-laktamy. Zwiększona ekspresja genów w szlaku pentozo-fosforanowym może znacząco zwiększyć komórkową zdolność antyoksydacyjną, zmniejszając tym samym uszkodzenia oksydacyjne spowodowane przez antybiotyki i przyczyniając się do zwiększonej oporności na leki. Upregulacja genów oporności na β-laktamy sugeruje, że szczep H1 rozwija mechanizmy przeciwdziałania antybiotykom β-laktamowym. Łącznie, aktywacja tych dwóch szlaków zwiększa przeżywalność bakterii w warunkach stresu antybiotykowego, wzmacniając rozwój oporności. Downregulowane geny były związane z montażem wici i chemotaksją bakteryjną. Te dwa procesy są kluczowe dla ruchliwości bakterii. Zmniejszona ekspresja genów w tych szlakach może prowadzić do zmniejszonej ruchliwości i zwiększonej zdolności do tworzenia biofilmu. Sugeruje to, że bakterie oporne na ciprofloksacynę mogą oszczędzać energię poprzez zmniejszenie ruchliwości, aby lepiej dostosować się do swojego środowiska, odzwierciedlając metaboliczny koszt adaptacji.

Wszystkie geny związane z chemotaksją i montażem wici były downregulowane w H1. Kluczowe geny zaangażowane w metabolizm puryn i pirymidyn (np. ndk, nrdA, nrdB, nrdD, pyk, adk, udp, cdd) były również upregulowane, sugerując potencjalną odpowiedź kompensacyjną na stres lekowy. Większość genów związanych z wirulencją, z wyjątkiem sopD2, była downregulowana w H1, z 36 genami znacząco downregulowanymi. Zarówno szczepy H1, jak i M wykazały znaczące wzbogacenie DEG w dwuskładnikowym systemie sygnalizacyjnym. W szczególności, citC, kluczowy gen w metabolizmie cytrynianu, był upregulowany 115,235-krotnie, wraz z genami oksydazy cytochromowej (cydA, cydB, cydX) i genami kodującymi systemy sygnalizacyjne (envZ i ompR). Upregulację zaobserwowano również w genach białek błony zewnętrznej (ompA i ompC), podczas gdy ompD i ompF były downregulowane. Dodatkowo, geny kodujące białka pomp efflux (AcrA, AcrB, AcrE, AcrZ, TolC) i regulatory transkrypcyjne (MarA i RamA) były znacząco upregulowane. Upregulacja wszystkich genów w szlaku pentozo-fosforanowym w H1 może wskazywać na odpowiedź kompensacyjną na uszkodzenia DNA indukowane przez ciprofloksacynę.

Analiza SNP zidentyfikowała mutacje niesynonimiczne w regionie eksonu H1. Wcześniejsze badania wykazały, że gyrB w H1 przeszedł mutacje, które mogą prowadzić do nadekspresji pomp efflux oporności wielolekowej. W H1 wiele genów związanych z pompą efflux jest upregulowanych, co prowadzi do zmniejszonej wrażliwości na różne antybiotyki. Dodatkowo, pojedynczą mutację wykryto w genie atpA, który koduje syntazę ATP, w szczepie H1. Ten gen jest kluczowy dla komórkowego metabolizmu energetycznego i wpływa na ekspresję wielu genów zaangażowanych w szlak fosforylacji oksydacyjnej. Ponadto, gen feoB, kodujący transporter jonów żelaza, przeszedł podwójne mutacje. System Feo ułatwia efektywne pobieranie żelaza, umożliwiając bakteriom przetrwanie i rozmnażanie w środowiskach ubogich w żelazo, zwiększając tym samym wirulencję bakterii. Co istotne, ekspresja genów związanych z wirulencją w szczepie H1 była znacząco downregulowana.

Wykresy PCA ilustrowały zmienność międzypróbkową na podstawie odległości między punktami próbek, ujawniając wyraźne różnice między opornym szczepem H1 a jego szczepem rodzicielskim M zarówno w trybie jonizacji kationowej, jak i anionowej. Na tych wykresach, skumulowana wariancja wyjaśniona przez PC1 i PC2 przekraczała 80%, wskazując, że pierwsze dwa główne składniki uchwycały większość zmienności w zestawie danych. Biologiczne powtórzenia każdej grupy mieściły się w elipsie ufności, a próbki kontroli jakości (QC) wykazały powtarzalność.

Które szlaki metaboliczne wspierają oporność?

Dziesięć najważniejszych istotnie różniących się szlaków metabolicznych (p < 0,05) wzbogaconych w H1 to metabolizm puryn, metabolizm glutationu, metabolizm octanu i dwukarboksylanu, metabolizm histydyny, biosynteza kwasu pantotenowego i koenzymu A, biosynteza karbocyjaniny, metabolizm estrów glicerolu, metabolizm pirymidyn, transporter ABC oraz metabolizm argininy i proliny. Metabolity z VIP > 1 i wartością p < 0,05 w H1 były uważane za istotnie różne metabolity. W szczególności, większość tych istotnie różnych metabolitów w H1 była związana z aminokwasami. Wśród nich, istotnie upregulowane metabolity obejmowały N2-(D-1-karboksyetylo)-L-lizynę, serylowalinę, L-(+)-argininę, glutaminylowalinę, Gamma-Glu-Leu, glutaminyloprololinę i L-glicylo-L-hydroksyprolinę, podczas gdy istotnie downregulowane metabolity obejmowały metionylometioninę, L-metioninę i histydynyloprololinę. Synteza argininy jest ściśle związana z metabolizmem glutaminy. Wzrost metabolitów glutaminy może pomóc bakteriom utrzymać metabolizm energetyczny w warunkach stresu antybiotykowego, zwiększyć zdolność antyoksydacyjną, a tym samym zwiększyć oporność. W mechanizmie oporności, zmiany w metabolitach metioniny mogą znacząco wpływać na wrażliwość bakterii na antybiotyki. Upregulowane metabolity aminokwasowe mogą przyczyniać się do naprawy uszkodzonych struktur komórkowych, podczas gdy downregulowane metabolity mogą być związane ze zmniejszonym wydatkowaniem energii. Te zmiany metaboliczne wspólnie wspierają przeżycie bakterii w niekorzystnych warunkach.

Wspólna analiza różnicowych genów i metabolitów wykazała zgodność między wynikami genotypowymi i fenotypowymi. Szlaki KEGG współwzbogacone zarówno dla różnicowych genów, jak i metabolitów obejmowały dwuskładnikowy system, transporter ABC, metabolizm puryn, szlak pentozo-fosforanowy, metabolizm glioksylanu i kwasu dwukarboksylowego, metabolizm aminocukrów i nukleotydów cukrowych, biosyntezę kwasu pantotenowego i koenzymu A, metabolizm pirymidyn, metabolizm biosyntezy argininy i proliny oraz metabolizm glutationu.

Szlak pentozo-fosforanowy w szczepie H1 był znacząco wzbogacony upregulowaną ekspresją genów takich jak pgi i zwf, promujących odpowiednio produkcję glukozo-6-fosforanu i NADPH. Wzrost NADPH może wspierać redukcję glutationu (GSH), zwiększać zdolność obrony antyoksydacyjnej komórek i tym samym zwiększać oporność na leki. W szlaku metabolizmu puryn, metabolity downstream ADP i cAMP w szlaku degradacji ATP oraz cGMP w szlaku degradacji GTP były upregulowane, wraz z powiązanymi genami regulacyjnymi ndk, nrdD, nrdA i nrdB. Upregulacja tych genów może być związana z przeprogramowaniem metabolizmu energetycznego bakterii w warunkach stresu antybiotykowego, pomagając bakteriom utrzymać poziomy ATP i tym samym wspierając kluczowe mechanizmy oporności. Jednakże, nukleozyd adeninowy, nukleozyd guaninowy i geny zaangażowane w katabolizm inozynomonofosforanu (IMP) (guaB i add) były downregulowane, prawdopodobnie z powodu hamowania szlaku de novo syntezy IMP. Metabolizm pirymidyn wykazał upregulację metabolitów downstream CMP, dCMP, dTMP i powiązanych genów (ndk, nrdD, nrdA, nrdB). Szlaki metabolizmu aminocukrów i nukleotydów cukrowych wykazały upregulację kwasu N-acetylo-neuraminowego (Neu5Ac), a transkryptomika ujawniła upregulację genów (nanA, nanE1 i nanM) regulujących ten szlak. Poziomy UDP-N-acetylomuraminanu (UDP-MurNAc) były zmniejszone, a downregulacja UDP-MurNAc może być związana ze szlakiem metabolicznym, w którym UDP-N-acetyloglukozamina (UDP-GlcNAc) głównie przyczynia się do syntezy Neu5Ac. Pod wpływem antybiotyków, niektóre metabolity downstream i ekspresje genów w szlakach metabolicznych puryn i pirymidyn bakterii są wzmocnione. Może to wskazywać, że bakterie aktywują szlaki de novo syntezy nukleotydów purynowych i pirymidynowych, aby zapewnić odpowiednią podaż. De novo synteza nukleotydów purynowych zaczyna się od 5-fosforybozolu, który jest stopniowo przekształcany w inozynomonofosforan (IMP), a następnie w adenozynomonofosforan (AMP) i guanozynomonofosforan (GMP). Szlak syntezy nukleotydów pirymidynowych zaczyna się od fosforanu karbamoilu, prowadząc do powstania orotianu, który jest następnie przekształcany w urydynomonofosforan (UMP), a dalej w cytydinotrifosforan (CTP) i deoksytymidynomonofosforan (dTMP). Wspólna analiza wykazała, że rozwój oporności na ciprofloksacynę u bakterii wymaga kompensacji w metabolizmie puryn i pirymidyn.

Wiele genów w transporterze ABC i dwuskładnikowym systemie zmieniło swoją ekspresję, wpływając na ruchliwość bakteryjną i chemotaksję, a także na stan błony komórkowej. W szlaku transportera ABC zaobserwowano podwyższone poziomy lizyny i argininy, obok obniżonych poziomów asparaginianu, glutaminianu i glutationu. Te zmiany mogą być związane z odpowiedziami antyoksydacyjnymi bakterii w warunkach stresu antybiotykowego, pomagając bakteriom zmniejszyć uszkodzenia spowodowane stresem oksydacyjnym. Metabolizm glioksylanu i dwukarboksylanu wykazał zwiększone poziomy (S)-jabłczanu, cytrynianu, L-winianu i 3-fosfo-D-glicerynianu, obok zmniejszenia L-glutaminianu. W metabolizmie glutationu, zmniejszone poziomy zredukowanego glutationu (GSH) i utlenionego glutationu (GSSG) wskazywały na odpowiedź antyoksydacyjną pod wpływem ciprofloksacyny. Biosynteza argininy i proliny wykazała zmniejszoną prolinę, ale zwiększone poziomy argininy, sugerując uzupełnienie z innych szlaków metabolicznych. Dodatkowo, biosynteza pantotenatu i koenzymu A (CoA) była upregulowana, ze zwiększoną ekspresją genu upstream (panC), dostarczając niezbędnych składników odżywczych dla H1. Te zmiany metaboliczne nie tylko wpływają na metabolizm energetyczny, ale mogą również zwiększać bakteryjną zdolność antyoksydacyjną i mechanizmy naprawy DNA poprzez regulację ekspresji genów i poziomów metabolitów, tym samym wzmacniając fenotyp oporności na leki.

Aktywacja bakteryjnych procesów metabolicznych oferuje obiecującą strategię walki z opornością na antybiotyki. To badanie skupiło się na lekach, które wykazały znaczący wzrost wielokrotności minimalnego stężenia hamującego (MIC), takich jak ciprofloksacyna, ceftriakson, ampicylina i tetracyklina, a także produktach metabolicznych aminokwasów, które znacząco zmieniły się w szczepie H1, w tym glutaminie, zredukowanym glutationie, kwasie glutaminowym, kwasie asparaginowym, metioninie i prolinie. Celem było zbadanie ich wpływu na oporność antybiotykową szczepu H1. Test szachownicy wykazał, że kombinacja glutaminy z tetracykliną dała indeks FIC równy 1, wskazując na efekt addytywny bez synergistycznego wzmocnienia. Stężenie subinhibicyjne tetracykliny zostało zmniejszone dwukrotnie w połączeniu z glutaminą. Inne produkty metaboliczne w połączeniu z ciprofloksacyną, ceftriaksonem, ampicyliną lub tetracykliną albo nie miały wpływu, albo nawet zwiększały oporność szczepu na ciprofloksacynę. Jednakże, kombinacje glutaminy, GSH, kwasu glutaminowego i kwasu asparaginowego z ampicyliną i ceftriaksonem, choć nie wykazywały efektu interakcji, mogły zmniejszyć MIC tych leków nawet 1024-krotnie. To znaczące zmniejszenie MIC sugeruje, że te związki mogą pośrednio zwiększać skuteczność antybiotyków poprzez mechanizmy takie jak hamowanie pompy efflux lub redukcja aktywności β-laktamazy.

Czy nowe strategie mogą przełamać oporność?

Wiele badań zgłosiło mutacje w genie gyrB. Na przykład, mutacja Asp426Asn w Escherichia coli wykazała zdolność do nadawania oporności na chinolony, podczas gdy mutacja Lys447Glu nadaje oporność na kwas nalidyksowy, ale zachowuje wrażliwość na ciprofloksacynę. W tym badaniu zidentyfikowaliśmy mutację Glu469Asp w GyrB. Ta mutacja została wcześniej zaobserwowana w opornych na chinolony Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa i Haemophilus influenzae, i była związana ze zmniejszoną wrażliwością na chinolony, chociaż nie została jeszcze zgłoszona w Salmonella. Nie wykryto mutacji w topoizomerazach ParC i ParE. W tym badaniu, indukowany szczep H1 nie tylko wykazuje oporność na leki fluorochinolonowe, ale także przekracza próg oporności dla różnych innych antybiotyków. Dlatego substytucja kwasu asparaginowego w pozycji 469 w genie gyrB szczepu H1 może mieć szersze implikacje dla oporności na leki. Ta mutacja może ujawnić nowe mechanizmy oporności, przyczyniając się do głębszego zrozumienia molekularnych podstaw oporności bakteryjnej. Wyjaśnienie wpływu tej mutacji może poprawić dokładność przewidywania oporności bakteryjnej na leki i tym samym kierować racjonalnym stosowaniem antybiotyków.

Ruchliwość bakteryjna jest głównie zależna od wici lub rzęsek, a ta zdolność odgrywa kluczową rolę w umożliwianiu bakteriom kolonizacji określonych miejsc, migracji w kierunku bardziej korzystnych środowisk i unikaniu niekorzystnych warunków. Analiza szlaku KEGG wykazała, że geny związane z ruchliwością bakteryjną i montażem wici były znacząco wzbogacone; jednak ekspresja genów związanych z ruchliwością była jednolicie downregulowana. Szczep H1 wykazał wyraźne zmniejszenie ruchliwości na stałych mediach, a mikroskopia elektronowa transmisyjna wykazała, że jego zdolność do tworzenia wici była zmniejszona w porównaniu z wrażliwym szczepem M. Biorąc pod uwagę, że ruchliwość zapośredniczona przez wici służy jako kluczowy determinant kolonizacji jelitowej u wielu organizmów, zdolność kolonizacji jelitowej szczepu H1 po ekspozycji na ciprofloksacynę może być osłabiona.

Bakteryjne biofilmy nadają tolerancję i oporność na antybiotyki poprzez różne mechanizmy. W szczepie H1, upregulacja genu ompA, który jest związany z adhezją bakteryjną i tworzeniem biofilmu, promuje rozwój biofilmu i zwiększa oporność na wiele antybiotyków. Zmniejszona ekspresja poryny błony zewnętrznej OmpF zmniejsza przepuszczalność błony, tym samym ograniczając wewnątrzkomórkową akumulację leku. To zmniejszenie ekspresji ompF w H1 prowadzi do zmniejszonej przepuszczalności błony komórkowej i dalej podnosi oporność bakteryjną. Dodatkowo, przepuszczalność błony komórkowej jest ściśle związana z wielolekowymi pompami efflux, podstawowym mechanizmem oporności na antybiotyki. W H1, geny marA, acrAB i tolC, które są zaangażowane w regulację pompy efflux, są znacząco upregulowane. Ponadto, geny downstream dwuskładnikowego systemu CitAB (citC, citG, citF, citE) i geny regulacyjne narL i torR wykazują wyraźną upregulację, potencjalnie pośrednicząc w oporności poprzez zmianę ekspresji determinantów oporności w H1.

Badania metabolomiczne wykazały, że szczepy Salmonella oporne na sarafloksacynę wykazują zmniejszone poziomy niektórych metabolitów zaangażowanych w metabolizm puryn/pirymidyn. Podobnie, w tym badaniu, zarówno zwiększone, jak i zmniejszone metabolity są wzbogacone w szlakach metabolicznych puryn/pirymidyn, sugerując silny związek między metabolizmem puryn a opornością bakteryjną. Badania wykazały również, że zakłócenie syntezy tymidylanu może przywrócić wrażliwość bakterii na cefalosporyny. Zmniejszenie zawartości dTMP może zwiększyć wrażliwość na antybiotyki poprzez zakłócenie równowagi między naprawą DNA a produkcją reaktywnych form tlenu (ROS). Podwyższone poziomy dTMP obserwowane w tym badaniu mogą być bezpośrednio związane z utrzymaniem oporności na leki. System glutationu służy jako kluczowy mechanizm obrony antyoksydacyjnej u bakterii Gram-ujemnych, a zmiany w biosyntezie glutationu odzwierciedlają zmiany w bakteryjnym stanie redoks. Badania wykazały, że bakteriobójcze antybiotyki mogą zmniejszyć stosunek GSH/GSSG w bakteriach. W tym badaniu, szlak metaboliczny glutationu w szczepie H1 był znacząco zmieniony, wskazując, że bakterie uruchomiły odpowiedź antyoksydacyjną. Ponadto, badania wykazały, że zarówno egzogenna (środowiskowa), jak i endogenna (biosyntetyczna) L-arginina promują tworzenie biofilmu poprzez modulowanie zawartości c-di-GMP i zmianę ekspresji składników strukturalnych macierzy pozakomórkowej. W tym badaniu, zwiększona zawartość argininy była związana ze wzmocnionym tworzeniem biofilmu i opornością na leki. Dodatkowo, egzogenna metionina wykazała promowanie wewnątrzkomórkowej akumulacji tigecykliny poprzez wzmocnienie bakteryjnej siły protonomotorycznej, skutecznie ponownie sensytyzując patogeny tet(X)-pozytywne na lek. W tym badaniu, poziomy metioniny w szczepie H1 były znacząco zmniejszone. Chociaż metionina nie wykazała efektu synergistycznego w połączeniu z ciprofloksacyną lub tetracykliną, mogła zmniejszyć MIC antybiotyków dla szczepu. Inne badanie analizujące zmiany transkrypcyjne w persisters Salmonella eksponowanych na 100× MIC ciprofloksacyny lub ceftazydymu przez 6 i 48 h wykazało, że tworzenie persisters po ekspozycji na ciprofloksacynę koreluje z nadekspresją genów zaangażowanych w odpowiedź SOS (recA), hamowanie podziału komórek (sulA), metabolizm żelazo-siarka (hscA i iscS) i systemy toksyna-antytoksyna typu I (tisB). Jednakże, w tym badaniu nie zaobserwowano znaczących zmian w ekspresji tych genów, prawdopodobnie z powodu różnic w użytych szczepach rodzicielskich.

Podsumowując, w tym badaniu zbadaliśmy mechanizmy leżące u podstaw indukowanej in vitro oporności na ciprofloksacynę u Salmonella za pomocą transkryptomiki, metabolomiki i podejścia łączonego. Nasze odkrycia ujawniły, że rozwój oporności w szczepie opornym na ciprofloksacynę (H1) był związany ze zmniejszoną ekspresją genów związanych z ruchliwością i wirulencją. Ponadto, podwyższone wartości MIC szczepu H1 przeciwko różnym lekom korelowały ze zwiększoną ekspresją pomp efflux, zmniejszoną ekspresją białek błony zewnętrznej i podwyższoną regulacją genów związanych z dwuskładnikowym systemem sygnalizacyjnym rządzącym pompami efflux i białkami błony zewnętrznej. Dodatkowo, znaleźliśmy upregulację kluczowych metabolitów w szlakach metabolicznych pirymidyn i puryn. Podsumowując, w przyszłych praktycznych zastosowaniach, inhibitory pompy efflux mogą być łączone z ciprofloksacyną w celu zwiększenia jej skuteczności przeciwbakteryjnej i opóźnienia rozwoju oporności. Dodatkowo, glutamina może być stosowana w połączeniu z tetracykliną w celu zmniejszenia dawki tetracykliny. Te niskokosztowe i wysoce bezpieczne schematy adjuwantów metabolicznych mogą być stosowane w leczeniu klinicznym i hodowli zwierząt, zmniejszając użycie antybiotyków i skutecznie ograniczając rozprzestrzenianie się oporności na fluorochinolony.

Podsumowanie

Badanie koncentruje się na analizie mechanizmów oporności bakterii Salmonella na antybiotyki, szczególnie na ciprofloksacynę. Poprzez 58-dniową indukcję in vitro uzyskano szczep H1 oporny na ciprofloksacynę, który wykazał zwiększoną oporność na 16 różnych leków. Zidentyfikowano kluczowe zmiany genetyczne, w tym mutację w genie gyrB oraz istotne modyfikacje w ekspresji genów związanych z transportem błonowym i metabolizmem komórkowym. Szczep H1 charakteryzował się zmniejszoną ruchliwością, zwiększoną zdolnością tworzenia biofilmu oraz zmianami w przepuszczalności błony komórkowej. Analiza metabolomiczna wykazała znaczące zmiany w szlakach metabolicznych związanych z aminokwasami, purynami i pirymidynami. Badanie sugeruje możliwość wykorzystania kombinacji metabolitów z antybiotykami jako strategii przeciwdziałania oporności, w tym zastosowanie glutaminy w połączeniu z tetracykliną dla zwiększenia skuteczności terapii.